Salmonella și tifoidă, paratifoid. Morfologia Salmonella Microbiologia Salmonella

Scopul lecției: să studieze principalele serotipuri de Salmonella și să fundamenteze necesitatea tipificării lor, să elaboreze metode de tipificare biochimică și serologică a Salmonella.

Plan de muncă:

Determinați genul de agenți patogeni ai toxiinfecțiilor alimentare prin studierea culturilor pe medii cu un rând scurt pestriț și pe agar cu trei zaharuri.

Luați în considerare principalele serotipuri de Salmonella și justificați necesitatea tipificării lor.

Efectuați tipificarea biochimică a agenților patogeni Salmonella prin studierea culturilor pe medii dintr-o serie lungă pestriță.

Efectuați tipizarea serologică a Salmonella folosind seruri de Salmonella aglutinante.

Luați în considerare evaluarea veterinară și sanitară a agenților patogeni de origine alimentară.

Suport material: medii cu inoculări realizate de elevii la lecția anterioară, 10 eprubete, pipete, lame de sticlă, o ansă bacteriologică, o punte bacteriologică, iaurt, un arzător cu gaz (alcool), seturi de complex diagnostic aglutinant Salmonella și seruri monoreceptoare, tabele (“ Creșterea agenților patogeni ai alimentelor, infecții toxice pe un rând lung pestriț”, „Schema de tipizare serologică pentru Salmonella”, „Compoziția primului set de seruri diagnostice de salmonella”), apă distilată, soluție de dezinfecție a mâinilor, alcool etilic.

Principalele serotipuri salmonelași ei valoare practicăÎn prezent sunt cunoscute peste 2.000 de serotipuri de Salmonella. Cele mai patogene pentru om și multe specii de animale domestice sunt: ​​S. typhi murium, pentru bovine S. Dublin, S. enteritidis; pentru porci: S. cholerae suis, S. typhi suis; pentru păsări: S. gallinarum, S. pullorum. Toate serotipurile de Salmonella de mai sus sunt patogene sau patogene condiționat pentru oameni. Salmonella este foarte rezistentă la tratamentul termic și poate persista mult timp în carne și alte alimente. În plus, trebuie remarcat faptul că bacteriile din genul Salmonella

au proprietăți predominant zaharolitice și practic nu secretă enzime proteolitice, prin urmare, examinarea organoleptică a produselor contaminate de obicei nu evidențiază modificări vizibile. Aceste proprietăți ale Salmonella contribuie la răspândirea pe scară largă a acestei toxiinfecții alimentare.

Semnificația tipificării Salmonella și a altor agenți patogeni de origine alimentară

Tipificarea agenților patogeni ai toxiinfecțiilor alimentare este necesară pentru a stabili patogenitatea acestui agent patogen pentru oameni și alte specii de animale; pentru a identifica sursa toxiinfecției alimentare; să dezvolte metode optime de tratare a toxiinfecțiilor alimentare și selectarea celor mai eficiente antibiotice și seruri terapeutice; pentru prevenirea salmonelozei și colibacilozei în ferme și selecția optimă a vaccinurilor și serurilor.

Tipificarea biochimică a agenților cauzali ai intoxicației alimentare

miercurea un lung şir pestriţ

Tiparea biochimică se bazează pe diferențele dintre anumite enzime Salmonella. Din cauza diferențelor enzimatice, unele bacterii sunt capabile să descompună anumiți carbohidrați sau alcooli, în timp ce altele nu. Pentru tipificarea biochimică se folosesc medii dintr-o serie lungă pestriță. Pentru a face acest lucru, este necesar să se țină cont de creșterea agenților patogeni de origine alimentară pe un rând lung pestriț. Dacă agentul patogen studiat descompune un anumit zahăr, atunci în timpul descompunerii sale, diverși acizi sunt eliberați, pH-ul mediului His devine acid, iar indicatorul lui Andrede devine mediu în roșu. Dacă zahărul nu este descompus, atunci mediul rămâne galben și reacția este considerată negativă. După luarea în considerare a reacției, rezultatele obținute sunt comparate cu proprietățile biochimice ale agenților cauzatori ai intoxicației alimentare (vezi Tabelul 5) și se identifică un serotip specific al bacteriei prin metoda eliminării.

Dacă, conform rezultatelor studiului, s-a dovedit că două sau mai multe serotipuri de Salmonella au aceleași proprietăți biochimice, atunci una dintre următoarele metode poate fi utilizată pentru a caracteriza agentul patogen: prelungirea rândului pestriț (re-însămânțare pe mediul His). cu acele zaharuri care sunt scindate diferit de serotipurile Salmonella comparate); să efectueze reacții serologice cu seruri monoreceptoare care reacţionează cu serotipurile de Salmonella comparate. Stabilirea serotipului Salmonella poate fi facilitată prin analiză logică (starea epizootică a așezării, geografia prevalenței serotipurilor comparate, patogenitatea acestora pentru această specie de animale).

Tipificarea biochimică a bacteriilor din genurile E. Coli și Proteus se realizează într-un mod similar (vezi Tabelul 6).

Cursul numărul 14.Familie Enterobacteriaceae . Gen Salmonella .

Caracteristicile generale ale familiei Enterobacteriaceae.

Bacteriile din această familie sunt cei mai frecventi agenți cauzali ai infecțiilor intestinale. Ele au o serie de caracteristici comune. Acestea sunt tije scurte, care nu formează spori, cu capete rotunjite, mobile (peritricos) sau imobile, unele au capsule. Aerobi sau anaerobi facultativi. O colorație Gram negativă este tipică. Ele cresc bine pe medii nutritive obișnuite cu extract de carne. Pe majoritatea mediilor dense, enterobacteriile formează colonii S- (netede) rotunde, convexe, strălucitoare, precum și forme R- (aspre) plate, inegale și granulare, adesea din cauza pierderii capsulei. Ele sunt caracterizate prin fermentarea glucozei (și a altor carbohidrați) cu formarea de acid și gaz. În raport cu lactoza, acestea se împart în lactoză-fermentantă și lactoză-nefermentantă. Catalaza - pozitiv, reface nitrații la nitriți.

Familia Enterobacteriaceae cuprinde peste 20 de genuri, unind peste 100 de specii de bacterii care trăiesc în sol, pe plante, care fac parte din biocenozele microbiene ale intestinelor animalelor și ale oamenilor. De cea mai mare importanță pentru om sunt genurile Escherichia, Salmonella, Shigella, Yersinia, Proteus, Klebsiella etc.Pentru diferențierea genurilor se folosesc în principal caracterele biochimice;pentru clasificarea în genuri și specii studiul structurii antigenice ( antigene O-, H- și K).

O antigen. reprezentate de lipopolizaharidele (LPS) ale membranei exterioare. Tulpinile lipsite de antigenul O formează colonii R și sunt de obicei avirulente.

H- antigen - proteinele termolabile sunt prezente numai la speciile mobile (care au flageli).

K- antigen- polizaharide termostabile ale capsulei și învelișului exterior.

În patogenia leziunilor cauzate de enterobacterii sunt importante LPS (endotoxina eliberată în timpul distrugerii bacteriilor), diverse enterotoxine, factorii de invazivitate și aderență (flagelele etc.) și enzimele de patogenitate.

GenSalmonella.

Salmonella este un grup mare de enterobacterii, printre care se numără diverse serotipuri - agenții cauzatori ai febrei tifoide, febrei paratifoide A, B și C și cele mai frecvente boli alimentare - salmoneloza. Pe baza patogenității pentru om, Salmonella este împărțită în patogenă pentru om - antroponoze (provoacă febră tifoidă și paratifoidă A și B) și patogenă pentru oameni și animale - zoonoze (provoacă salmoneloză). În ciuda diferențelor semnificative în caracteristicile antigenice Salmonella, proprietăți biochimice, boli cauzate de acestea, conform clasificării moderne, dar nu suficient de convenabile și perfecte, se disting două specii - S.bongori și S.enteritica. Acesta din urmă este împărțit în subspecii, dintre care subspeciile choleraesuis și salamae sunt cele mai importante. Subspecia choleraesuis conține cea mai mare proporție de serovare de Salmonella cunoscute (aproximativ 1400 din aproximativ 2400).

Morfologie. Tije gram-negative drepte cu dimensiunea de 2-4 x 0,5 µm. Mobil datorită prezenței flagelilor peritric.

Proprietăți culturale și biochimice. Anaerobii facultativi cresc bine pe medii nutritive simple. pH optim - 7,2-7,4, temperatura - +37. Metabolism - oxidativ și fermentativ. Salmonella fermentează glucoza și alți carbohidrați pentru a produce acid și gaz (serotipul Salmonella typhi nu produce gaze). De obicei, nu se fermentează lactoza (pe medii cu acest carbohidrat - colonii incolore), zaharoză. Oxidază negativă, catalază pozitivă. Reacția Voges-Proskauer este negativă.

Pe baza proprietăților biochimice (enzimatice) ale salmonelei sunt împărțite în patru grupuri. Semne caracteristice ale salmonellei - producția de hidrogen sulfurat, lipsa producției de indol și aerobicitate. Pentru izolare se folosesc medii de diagnostic diferenţial (agar bismut-sulfit, Endo, Ploskirev, SS agar) şi medii de îmbogăţire (bulion selenit, bulion biliar, mediu Rappoport). Formele S formează colonii mici (de la 1 la 4 mm) transparente (pe mediu Endo - roz, pe mediu Ploskirev - incolor, pe bismut - agar sulfit - negru, cu un luciu metalic). Pe medii lichide, formele S dau turbiditate uniformă, formele R precipită.

Structura antigenică. Alocați antigenele O-, H- și K-. Grupul de antigene K include antigenele Vi (antigeni de virulență). Datorită locației sale mai superficiale (decât antigenele O), antigenul Vi poate preveni aglutinarea culturilor de Salmonella de către serul O-specific (protecție). Pentru a diferenția Salmonella se folosește o schemă (clasificare serologică) Kaufmann - Alb.

În funcție de structura antigenelor O, Salmonella este împărțită în O-grupuri(67 de serogrupuri), fiecare dintre ele include tipuri serologice, care diferă în structura antigenelor H. Apartenența Salmonelei la un anumit serovar se stabilește prin studierea structurii antigenice în conformitate cu schema Kaufmann-White. Exemple: serotipul S.paratyphi A aparține serogrupului A, S.paratyphi B - serogrupului B, S.paratyphi C - grupului C, S.typhi - serogrupului D.

factori de patogenitate.

1. Factori de aderență și colonizare.

3.Endotoxina (LPS).

4. Enterotoxine termolabile și termostabile.

5. Citotoxine.

6. Plasmidele de virulență și plasmidele R sunt esențiale.

7. Vi - antigenul inhiba actiunea factorilor bactericidi serici si fagocitari.

Principalii factori de patogenitate ai Salmonelei sunt capacitatea lor de a pătrunde în macrofage și de a se multiplica în formațiunile limfoide ale stratului mucos al intestinului subțire (plasturi Peyer, foliculi solitari), precum și producția de endotoxină.

Patogenia leziunilor. Diferențele în formele clinice ale bolilor cauzate de Salmonella depind de virulența și doza agentului patogen și de starea sistemului imunitar al organismului. Doza uzuală care provoacă manifestări clinice este de 10 6 - 10 9 bacterii, o doză mai mică este suficientă pentru imunodeficiențe, hipoclorhidrie și alte boli ale tractului gastrointestinal.

Există următoarele forme principale de infecție cu Salmonella:

Gastrointestinal;

Generalizate (variante asemănătoare tifoidă și septicopemică);

Purtător bacterian (acut, cronic, tranzitoriu).

Caracteristicile patogenetice semnificative ale procesului infecțios cauzate de serotipurile S.typhi, S.paratyphi A,B stau la baza repartizării bolilor tifoide și paratifoide într-un grup nosologic independent. Fiecare fază a patogenezei corespunde perioadei clinice a bolii și propriei sale tactici de examinare de laborator. Fazele principale sunt introducerea agentului patogen (corespunzător perioadei de incubație), localizarea primară a agentului patogen (perioada prodromală), bacteriemia (prima săptămână a bolii), localizarea secundară a salmonelei (înălțimea bolii este 2-3 săptămâni), excretor-alergic (reconvalescență - 4 săptămâni de boală).

Intrat pe gură, Salmonella pătrunde prin endocitoză în celulele epiteliale ale duodenului și intestinului subțire. Ele pătrund ușor în celulele epiteliale, dar nu se înmulțesc aici, ci trec și se înmulțesc în aparatul limfatic al intestinului subțire. Salmonella se înmulțește în principal în lamina propria (localizare primară), care este însoțită de o reacție inflamatorie locală a membranei mucoase, flux de lichid în leziune și dezvoltarea sindromului diareic (gastroenterită). Enterotoxinele cresc nivelul de adenomonofosfat ciclic (cAMP), există o creștere a nivelului de histamină și alte substanțe biologic active, permeabilitatea vasculară. Se observă tulburări de apă și electroliți, se dezvoltă hipoxie și acidoză, care se agravează proces patologic cu predominanţa tulburărilor vasculare. Există o distrugere a unei părți a Salmonella cu eliberarea de endotoxină, sensibilizarea (HRT) a aparatului limfatic al intestinului subțire.

Din membrana mucoasă, Salmonella poate intra în limfă și mai departe în fluxul sanguin, provocând bacteriemie. În cele mai multe cazuri, este de natură trecătoare, deoarece. Salmonella este eliminată de către fagocite.

Spre deosebire de alte salmonele, agenții cauzatori ai tifoidei și paratifoidei, care au pătruns în fluxul sanguin, sunt capabili să supraviețuiască și să se înmulțească în fagocite. Se pot multiplica în ganglionii limfatici mezenterici, ficat și splină și provoacă o generalizare a procesului. După moartea fagocitelor, Salmonella intră din nou în fluxul sanguin. În același timp, antigenul Vi inhibă factorii bactericidi.

Când Salmonella moare, se eliberează endotoxina, care inhibă activitatea centrală sistem nervos(tifus - din greacă. typhos - ceață, conștiință confuză) și provoacă o febră prelungită. Acțiunea endotoxinei poate provoca miocardită, distrofie miocardică, șoc infecțios-toxic.

Ca urmare a bacteriemiei, apare o infecție generalizată a vezicii biliare, rinichilor, ficatului, măduvei osoase și durei mater (localizare secundară a Salmonella). Există o invazie secundară a epiteliului intestinal, în special a peticelor lui Peyer. În peretele sensibilizat de salmonella se dezvoltă inflamația alergică odată cu formarea principalei complicații formidabile - ulcerul tifoid. Transportul pe termen lung al Salmonella în vezica biliara cu eliberarea agentului patogen cu fecale, pielonefrită, sângerare și perforare a intestinului cu înfrângerea plasturilor lui Peyer. Apoi, există formarea imunității post-infecțioase, eliminarea agentului patogen și vindecarea ulcerelor sau formarea unui bacteriopurtător (în Siberia de Vest, adesea pe fondul opistorhiozei cronice).

Agenții cauzali ai salmonelozei sunt alte serotipuri de Salmonella care sunt patogene pentru oameni și animale (S.typhimurium, S.enteritidis, S.heldelberg, S. newport și altele). Patogenia salmonelozei se bazează pe acțiunea agentului patogen însuși (interacțiunea acestuia cu organismul gazdă) și a endotoxinei care se acumulează în produsele alimentare infectate cu salmonella. În varianta clasică, infecția toxică cu Salmonella este gastroenterita. Cu toate acestea, atunci când bariera limfatică a intestinului este ruptă, se pot dezvolta forme generalizate și extraintestinale de salmoneloză (meningită, pleurezie, endocardită, artrită, abcese hepatice și splinei, pielonefrită etc.). Creșterea formelor generalizate și extraintestinale de salmoneloză este asociată cu o creștere a numărului de stări de imunodeficiență, care este de o importanță deosebită în infecția cu HIV.

O problemă separată este prezentată de tulpinile spitalicești de Salmonella (mai des individuale S. typhimurium fagovars), care provoacă focare de infecții nosocomiale în principal în rândul nou-născuților și copiilor debili. Se transmit predominant prin contactul gospodăresc de la copiii bolnavi și purtători de bacterii, au o activitate invazivă ridicată, provocând adesea bacteriemie și sepsis. Tulpinile epidemice se caracterizează prin rezistență la medicamente multiple (R-plasmide), rezistență ridicată, inclusiv la temperaturi ridicate.

caracteristici epidemiologice. Caracterizat prin distribuție omniprezentă. Principalele rezervoare de Salmonella sunt oamenii (agenți cauzatori ai tifosului și paratifoidului A) și diverse animale (alte serotipuri de Salmonella). Principalii agenți patogeni sunt polipatogeni. Principalele surse de infecție sunt carnea și produsele lactate, ouăle, carnea de pasăre și produsele din pește. Principalele căi de transmitere sunt alimentele și apa, mai rar - contactul. Este caracteristică o multiplicitate extremă de rezervoare și posibile surse de infecție. Animalele de fermă și păsările au o importanță primordială.

Diagnosticul de laborator. Metoda principală este bacteriologică. Pe baza patogenezei, termenii optimi pentru studii bacteriologice în forme gastrointestinale sunt primele zile, cu forme generalizate - sfârşitul celei de-a doua - începutul celei de-a treia săptămâni de boală. În studiul diferitelor materiale (fecale, sânge, urină, bilă, vărsături, reziduuri alimentare), cea mai mare frecvență a rezultatelor pozitive se observă în studiul fecalelor, pentru agentul cauzator al febrei tifoide și al paratifoidului - sânge (hemocultura).

Cercetarea se desfășoară conform schemei standard. Materialul de testat este inoculat pe medii dense de diagnostic diferențial - foarte selective (agar bismut sulfit, agar verde strălucitor), mediu selectiv (mediu Ploskirev, agar slab alcalin), selectiv scăzut (agar Endo și Levin) și mediu de îmbogățire. Mediul Rapoport este utilizat pentru hemocultură. Pe agar bismut-sulfit, coloniile de Salmonella capătă o culoare neagră (rar verzui) Coloniile crescute sunt subcultivate pe medii pentru identificare primară (medii Ressel) și biochimice (hidrogen sulfurat, uree, glucoză, lactoză). Pentru identificarea preliminară se folosește fagul O1-Salmonella, la care până la 98% din Salmonella sunt sensibile.

Pentru identificarea culturilor în RA se folosesc antiseruri O-, H- și Vi- polivalente și monovalente. În primul rând, sunt utilizate seruri de O și H polivalente adsorbite și apoi serurile de O și H monovalente corespunzătoare. Pentru a identifica agenții cauzatori ai febrei tifoide și ai paratifoidelor, se folosesc anticorpi la antigenul O2 (S.paratyphi A), O4 (S.paratyphi B), O9 (S.typhi). Dacă cultura nu se aglutinează cu O-ser, aceasta trebuie examinată cu Vi-ser. Pentru detectarea rapidă a Salmonella se folosesc seruri luminiscente polivalente.

Sunt efectuate studii serologice pentru diagnostic, precum și pentru identificarea și diferențierea diferitelor forme de transport. Aplicați RA (reacție Vidal) cu diagnostice O- și H- și RPHA utilizând diagnostice eritrocitare polivalente care conțin antigene polizaharide ale serogrupurilor A, B, C, D și E și antigen Vi-.

Tratament- antibiotice (levomicetina etc.). Sunt adesea găsite tulpini rezistente la antibiotice. Este necesar să se determine rezistența la antibiotice a culturilor izolate.

Profilaxia specifică poate fi folosit în primul rând pentru febra tifoidă. Aplicați monovaccin antitifoid adsorbit chimic. Vaccinarea este utilizată în prezent în principal pentru indicații epidemice.

La bulionul de carne-peptonă se adaugă agar 3-4%, se ajustează pH-ul la 7,6, se toarnă în baloane de 100 ml și se sterilizează, ca de obicei, în autoclavă, păstrându-se în această formă până la prepararea agarului fucsin-sulfit. Preparați fuchsin sulfit agar în ziua utilizării. Este imposibil să vă pregătiți pentru viitor și să stocați acest mediu, deoarece devine rapid roșu.

La 100 ml de agar peptonă 3-4% carne topit și răcit la 70°C se adaugă steril 1 g lactoză, dizolvată în prealabil și fiert în 5 ml apă sterilă. În plus, se adaugă aici 0,5 ml de soluție alcoolică saturată filtrată de fuchsin bazic și 2,5 ml de soluție de sulfat de sodiu 10% proaspăt preparată. Sulfitul de sodiu (Na2SO3) în cantitate de 0,5 g se dizolvă în 5 ml apă și se sterilizează prin fierbere înainte de utilizare.

O poți face puțin diferit. Fuchsinul și sulfitul de sodiu se amestecă mai întâi într-o eprubetă: se adaugă o soluție de sulfit de sodiu la 0,5 ml de soluție de fucsină cu agitare până când lichidul din eprubetă devine incolor sau ușor roz. Și acest amestec se toarnă în agarul topit și oarecum răcit. Balonul cu mediu se agită bine pentru a se amesteca și mediul se toarnă în vase Petri. După solidificarea mediului, acesta este uscat într-un termostat la 37°C timp de 30 min.

Când este fierbinte, mediul trebuie să fie ușor roz la culoare, iar după răcire complet incolor. Decolorarea fuchsinei în mediul Endo este cauzată de sulfitul de sodiu introdus.

Simmons miercuri

La identificarea microbilor grupului coli (pentru a distinge speciile de sol Escherichia coli aerogenes de specia fecală Escherichia coli comuna), se utilizează mediul citrat Simmons. În 1 litru de apă distilată, se dizolvă 1,5 g de fosfat de sodiu (sau fosfat de amoniu monosubstituit), 1 g de fosfat de potasiu monosubstituit (KH2PO4), 0,2 g de sulfat de magneziu, 2,5-3 g de citrat de sodiu cristalin, se stabilește pH 7,0 -7,2 , se adaugă 2% agar și, după ce a topit mediul, se toarnă în baloane de 100 ml. Se sterilizează în autoclavă timp de 15 minute la 120°C.

Un indicator trebuie adăugat la mediu înainte de utilizare. Se poate folosi fie albastru de bromtimol, fie fenolrot. Indicatorul se adaugă la 100 ml de mediu topit. Bromothymolblau se ia într-o cantitate de 1 ml dintr-o soluție alcoolică 1,5%. Mediul devine verde măsliniu. Phenolrot se adaugă în cantitate de 2 ml dintr-o soluție de alcool 1,5%. Mediul devine galben. După adăugarea indicatorului, mediul este turnat în eprubete și sterilizat într-o autoclavă la 120°C timp de 15 min.

Seria pestriță de carbohidrați sau mediul lui Hiss

Mediile Giss sunt folosite pentru a determina capacitatea enzimatică a microorganismelor. În funcție de prezența uneia sau alteia enzime într-o celulă microbiană, este capabilă să descompună oricare dintre carbohidrați cu formarea anumitor produși de descompunere, prin urmare, orice carbohidrat este introdus în mediu: lactoză, glucoză, manitol, zaharoză, etc. Un set de astfel de medii a fost obținută denumirea de „seria pestriță de carbohidrați”.

Mai întâi se prepară apă peptonă: se iau 10 g peptonă și 5 g sare de masă pură chimic pentru 1 litru de apă distilată, se fierbe până când peptona se dizolvă, se filtrează printr-un filtru de hârtie (filtratul trebuie să fie complet transparent) și se stabilește pH-ul. 7,2-7,4. Apoi, la 100 ml de apă peptonă se adaugă 0,5 g dintr-unul dintre carbohidrații utilizați și 1 ml indicator Andrede.

Compoziția indicatorului Andrede include: 0,5 g fucsin acid, 16 ml 1 N. soluție de hidroxid de sodiu (NaOH) și 100 ml apă distilată. Dacă este necesar, indicatorul poate fi pregătit în avans și păstrat într-un loc întunecat după fierbere la 100 °C timp de 15 minute. După introducerea indicatorului, mediile sunt turnate în eprubete cu flotoare și sterilizate într-un cazan Koch de trei ori timp de 30 de minute. La sfârșitul sterilizării, flotoarele trebuie scufundate într-un mediu in caz contrar flaconul nu poate fi utilizat. Suporturile cu reactivul lui Andrede sunt de culoare galben-pai fără nuanta roz. Odată cu dezvoltarea microorganismelor în mediu, acestea din urmă, descompunând zahărul cu formarea de acid, provoacă o modificare a reacției. Și deoarece indicatorul Andrede devine roșu într-un mediu acid, aceasta este o dovadă că microorganismul folosește acest zahăr pentru viața sa. Absența înroșirii, dimpotrivă, indică absența în complexul enzimatic al microbilor studiat a unei enzime care descompune carbohidratul prezent în mediu.

Activitatea enzimatică a microorganismelor este bogată și variată. Vă permite să stabiliți afilierea speciilor și tipului, să determinați variantele biologice ale microbilor. Există o serie de enzime a căror activitate poate determina gradul de patogenitate a unui microorganism.

Pentru a determina activitatea enzimatică (biochimică) a microbilor, se folosesc medii de diagnostic diferențial.

Mediile de diagnostic diferenţial includ mediile Giss, pe care se studiază activitatea zaharolitică a microorganismelor.

Suportul poate fi lichid sau solid. Baza mediilor Giss este bulionul de carne - peptonă (MPB) și agarul de carne - peptonă (MPA). Aceste medii includ un carbohidrat și un indicator. Există două serii de medii Giss - mari (inclusiv 27 de articole) și mici. O gamă mică de medii Hiss include maltoză, glucoză, zaharoză, naluci și lactoză. Setarea inițială a pH-ului mediului este ușor alcalină (7,2 - 7,4).

Dacă, în timpul cultivării microbilor, substratul este degradat la acid, atunci pH-ul mediului se schimbă în partea acidă și, în același timp, culoarea indicatorului se schimbă. O schimbare a culorii mediului nutritiv este un indicator al prezenței unei enzime într-un anumit microb care descompune un anumit substrat în acid. Atât într-un mediu lichid, cât și într-un mediu nutritiv dens, prezența unei enzime care descompune substratul în acid este apreciată de o schimbare a culorii indicatorului.

Formarea gazului este determinată de acumularea de bule de gaz în grosimea agarului și de ruperea agarului (dacă mediile His sunt dense) sau de acumularea de bule de gaz în flotor (dacă mediile sunt lichide) . Un flotor este un tub îngust de sticlă cu capătul etanșat în sus, care este plasat într-o eprubetă cu un mediu înainte ca mediul să fie sterilizat.

Diferența dintre setul de enzime care descompun carbohidrații poate fi utilizată în diferențierea microbilor înrudiți, de exemplu, Salmonella, Shigella, Escherichia. Deci, pe mediile Endo, Levin, Ploskirev, care includ lactoză și un indicator (colorant de anilină), coloniile de Escherichia coli vor deveni violet (pe mediile Levin) sau liliac (pe mediile Endo și Ploskirev). Coloniile de Salmonella și Shigella pe același mediu vor fi incolore.

Acest lucru se datorează faptului că Escherichia coli, având enzima lactază, descompune lactoza, rezultând formarea de acid, pH-ul mediului se schimbă pe partea acidă și apare culoarea indicatorului, colorantul de anilină. Specimenele de coli se colorează bine cu colorant de anilină, iar colecția de indivizi colorați reprezintă o colonie colorată.

Shigella și Salmonella nu au enzima lactază și nu descompun lactoza, pH-ul mediului nu se modifică, indicatorul nu apare, celulele microbiene nu se colorează. Prin urmare, coloniile de Salmonella și Shigella de pe mediile Endo și Ploskirev vor fi incolore.

Prezența enzimei amilază poate fi apreciată prin însămânțarea culturii pe un mediu care conține amidon. Dacă există o enzimă care descompune amidonul, atunci când o picătură de soluție Lugol este adăugată în eprubetă, mediul nu va deveni albastru. Amidonul nedescompus, atunci când este adăugat cu soluția Lugol, dă o culoare albastră.

Proprietățile proteolitice (adică capacitatea de a descompune proteinele, polipeptidele etc.) sunt studiate pe medii cu gelatină, lapte, zer, peptonă. Odată cu creșterea microbilor care fermentează gelatina pe mediul de gelatină, mediul se lichefiază. Natura lichefierii cauzate de diferiți microbi este diferită.

La împărțirea cu peptonă, indol, skatol, hidrogen sulfurat, amoniac poate fi eliberat. Formarea lor se stabilește cu ajutorul indicatorilor. De exemplu, hârtia de filtru este preimpregnată cu o soluție indicator, uscată, tăiată în fâșii înguste de 5–6 cm lungime, iar după semănat cultura pe BCH, plasată sub dopul (între dopul și peretele eprubetei). După incubare într-un termostat, țin cont de rezultat. Amoniacul face ca hârtia de turnesol să devină albastră; când hidrogenul sulfurat este eliberat pe o bucată de hârtie înmuiată într-o soluție de 20% de acetat de plumb și bicarbonat de sodiu, se formează sulfat de plumb - o sare neagră, iar hârtia indicator devine neagră. Indolul contribuie la înroșirea unei bucăți de hârtie înmuiată într-o soluție de acid oxalic.

Proprietățile hemolitice ale microbilor pot fi detectate folosind agar-sânge. Dacă microbul are enzima hemolizină, atunci vor exista zone de liză a eritrocitelor în jurul coloniilor acestui microb (în aceste zone, agar-ul va fi incolor).

Enzima lecitinaza este detectată prin inocularea culturii pe agar cu sare de gălbenuș. În jurul coloniei microbilor care produce această enzimă se formează un halou mat.

Trebuie amintit că prezența diferitelor enzime determină proprietățile biochimice ale microbilor.

Proprietățile culturale și biochimice ale agenților cauzatori ai intoxicației alimentare

Compoziția enzimatică a oricărui microorganism este o caracteristică destul de constantă în condiții normale, de exemplu. diferitele tipuri de microorganisme diferă în setul de enzime.

Studiul compoziției enzimatice este important pentru diferențierea și identificarea diferitelor microorganisme.

Metode speciale de colorare a bacteriilor. Metodele Gram și Ziehl-Nielsen au găsit cea mai mare distribuție.

Metode de diferențiere folosit de obicei pentru colorarea diferitelor structuri morfologice.

Capsule. Metodele lui Hiss, Leifson și Anthony sunt folosite pentru colorarea capsulelor bacteriene; cea din urmă metodă este cea mai simplă și presupune colorarea cu cristal violet urmată de tratare cu CuSO4 apos 20%.

Flagelii. Pentru colorarea flagelilor au fost propuse metodele lui Löffler, Bailey, Gray și altele.Aceste metode sunt caracterizate prin gravarea inițială a preparatului și colorarea ulterioară (mai des, fuchsinul carbolic al lui Ziehl).

Dispute. Sporii bacterieni sunt colorați după tratamentul preliminar al pereților lor. Cea mai simplă este metoda lui Peshkov, care include fierberea unui frotiu cu albastru Loeffler pe o lamă de sticlă, urmată de colorarea cu roșu neutru. Sporii colorează albastru, celulele vegetative sunt roz.

Metode de cultură

La creșterea bacteriilor, se utilizează metoda staționară, metoda cultivării profunde cu aerare și metoda curgării mediilor nutritive. În conformitate cu metodele de cultivare, culturile bacteriene se împart în periodice (cu cultivare staționară și profundă) și continue (cu cultivare în flux).

Metoda staționară este cel mai des folosit în practică. Compoziția mass-media rămâne constantă; nu se efectuează manipulări suplimentare cu acestea.

Metoda culturii profunde sunt utilizate în cultivarea industrială a biomasei bacteriene, pentru care se folosesc cazane-reactoare speciale. Sunt echipate cu sisteme de menținere a temperaturii, furnizarea de diverși nutrienți bulionului, amestecarea biomasei și furnizarea constantă de oxigen. Crearea de condiții aerobe pe toată grosimea mediului contribuie la fluxul proceselor energetice de-a lungul căii aerobe, ceea ce contribuie la utilizarea maximă a potențialului energetic al glucozei și, în consecință, la randamentul maxim de biomasă.

Metoda fluxului media(metoda de cultivare industrială) vă permite să mențineți constant o cultură bacteriană într-o fază de creștere exponențială, care se realizează prin adăugarea constantă de nutrienți și eliminarea un anumit număr celule bacteriene. Prezența bacteriilor în stadiul de creștere exponențială asigură randamentul maxim al diferitelor substanțe biologic active (vitamine, antibiotice etc.).

Identificarea primară a bacteriilor

În cele mai multe cazuri, studiul caracteristicilor de creștere pentru identificarea primară a agenților patogeni se efectuează pe colonii care au crescut în 18-24 de ore.Natura creșterii bacteriene pe diverse medii poate oferi o mulțime de informații utile. În practică, se utilizează un set relativ mic de criterii. În mediile lichide, natura suprafeței (formarea peliculei) sau creșterea aproape de fund (tipul de sediment) și turbiditatea generală a mediului sunt de obicei luate în considerare. Bacteriile formează colonii pe medii solide, adică structuri izolate rezultate din creșterea și acumularea bacteriilor. Coloniile apar ca urmare a creșterii și reproducerii uneia sau mai multor celule. Astfel, reînsămânțarea din colonie face în continuare posibilă operarea cu o cultură pură a agentului patogen. Creșterea bacteriilor pe medii dense are trăsături mai caracteristice.

Unele bacterii secretă hemolizinele- substante care distrug globulele rosii. Pe navă spațială, coloniile lor sunt înconjurate de zone de defrișare. Formarea hemolizinelor (și, în consecință, dimensiunea zonelor de hemoliză) poate fi variabilă, iar pentru o determinare adecvată a activității hemolitice, vasele cu culturi trebuie privite împotriva unei surse de lumină (Fig. 1-14). Activitatea hemolizinelor se poate manifesta prin distrugerea completă sau incompletă a globulelor roșii.

α-Hemoliza. Distrugerea eritrocitelor poate fi incompletă, cu conservarea stromei celulare. Acest fenomen se numește α-hemoliză. Iluminarea mediului din jurul coloniilor este de obicei nesemnificativă, ulterior mediul din jurul coloniilor poate căpăta o culoare verzuie.

În practica bacteriologică, cel mai des sunt studiate enzimele zaharolitice și proteolitice.

O astfel de creștere este tipică pentru pneumococ, precum și pentru un grup de așa-numiții streptococi verzi.

β-Hemoliza. Un grup mult mai mare de bacterii provoacă distrugerea completă a celulelor roșii din sânge sau β-hemoliza. Coloniile lor sunt înconjurate de zone transparente de diferite dimensiuni. De exemplu, Streptococcus pyogenesși Staphylococcus aureus formează zone mari de hemoliză, a Listeria monocytogenes sau Streptococcus agalactiae- zone mici, difuze. Pentru a determina activitatea hemolitică, agar-ciocolată (SHA) nu trebuie utilizat, deoarece zonele rezultate ale hemolizei α sau β nu au trăsături caracteristice și provoacă aceeași înverzire a mediului.

Mărimea și forma coloniilor

Caracteristicile importante ale coloniilor sunt dimensiunea și forma lor. Coloniile pot fi mari sau mici. Dimensiunea coloniilor este o caracteristică care face posibilă distingerea între diferitele specii, genuri și chiar tipuri de bacterii.

În cele mai multe cazuri, coloniile bacteriene gram-pozitive sunt mai mici decât coloniile bacteriene gram-negative. Coloniile de bacterii pot fi plate, ridicate, convexe, au un centru deprimat sau ridicat. O altă caracteristică importantă este forma marginilor coloniilor. Când se studiază forma coloniilor, se ține cont de natura suprafeței acesteia: mată, strălucitoare, netedă sau aspră. Marginile coloniilor pot fi netede, ondulate, lobulate (profund indentate), zimțate, erodate, franjuri etc. Mărimea și forma coloniilor se pot schimba adesea. Astfel de modificări sunt cunoscute sub denumirea de disocieri. Cel mai adesea găsesc asocieri S - și R - duc. Coloniile S sunt rotunde, netede și convexe, cu margini netede și o suprafață strălucitoare. Colonii R - de formă neregulată, aspre, cu margini zimțate.

Culoarea coloniei

Când vizualizați culturile, acordați atenție și culorii coloniilor. Mai des sunt incolore, albe, albăstrui, galbene sau bej; mai rar - roșu, violet, verde sau negru. Uneori, coloniile sunt irizate, adică strălucesc cu toate culorile curcubeului. Colorarea apare ca urmare a capacității bacteriilor de a forma pigment. Pe medii speciale de diferențiere care conțin ingrediente sau coloranți speciali, coloniile pot dobândi o varietate de culori (negru, albastru etc.) datorită includerii coloranților sau recuperării lor dintr-o formă incoloră. În acest caz, culoarea lor nu este asociată cu formarea de pigmenți.

Consistența coloniilor și caracteristicile creșterii pe mediu

Informații utile pot fi date de consistența coloniilor și de caracteristicile de creștere pe mediu. De obicei, aceste informații pot fi obținute prin atingerea coloniilor cu o buclă. Coloniile pot fi îndepărtate cu ușurință din mediu, pot crește în el sau pot provoca coroziunea acestuia (formând fisuri și denivelări). Consistența coloniilor poate fi tare sau moale. colonii moi- uleios sau cremos; poate fi lipicioasă (se lipește de buclă) sau scăzută (se întinde în spatele buclei).

colonii dure- uscat, ceros, fibros sau sfărâmicios; poate fi casant și rupe atunci când este atins de buclă.

Mirosul este un semn mai puțin important al coloniilor, deoarece asociațiile pe care le evocă sunt subiective. În special, culturile de Pseudomonas aeruginosa au miros de caramel, culturile de Listeria - zer, Proteus - un miros putred, Nocardia - pământ proaspăt săpat.

Metode biochimice de identificare a bacteriilor

Există o mulțime de metode folosite pentru a identifica caracteristicile metabolismului bacterian, dar în practică se utilizează un număr mic dintre ele. Majoritatea metodelor se bazează pe utilizarea unor medii de diagnostic diferenţial care includ diverşi indicatori.

Capacitatea de a fermenta carbohidrații

Capacitatea de fermentare a carbohidraților se evaluează prin modificarea culorii mediului datorită formării acizilor organici (respectiv, are loc o scădere a pH-ului), determinând o modificare a culorii indicatorului.

Rândul „Pestriț”. Pentru determinarea activității zaharolitice se folosesc medii Hiss; conțin 1% apă peptonă (sau MPB), un indicator Andrade și unul dintre carbohidrați. Când carbohidrații sunt scindați, culoarea mediului se schimbă de la galben la roșu. Deoarece bacteriile se disting prin capacitatea lor de a fermenta anumiți carbohidrați, rândurile de eprubete capătă un aspect pestriț. Prin urmare, acest set de medii se numește seria „pestriță” (sau colorată).

Plutitoare de sticla. Pentru a determina capacitatea microorganismelor de a fermenta carbohidrații cu formarea de acid și gaz, în vase cu medii se introduc flotoare de sticlă (tuburi scurte sigilate la un capăt), care plutesc în sus după umplerea lor cu gaz.

Defalcarea proteinelor

Unele bacterii prezintă activitate proteolitică prin secretarea de proteaze care catalizează descompunerea proteinelor. Prezența enzimelor proteolitice din grupul colagenazelor este determinată prin inoculare cu o injecție în NRM. Cu un rezultat pozitiv, lichefierea sa se observă sub formă de pâlnie sau în straturi de sus în jos. Capacitatea de a scinda proteinele și aminoacizii poate fi evaluată și prin schimbarea culorii mediului, deoarece produsele rezultate - amoniac, indol și hidrogen sulfurat - schimbă pH-ul pe partea alcalină, provocând o schimbare a culorii indicatorului.

formarea amoniacului. Pentru a determina capacitatea de a forma NH3, semănatul se efectuează în BCH, iar între suprafața sa și plută este fixată o fâșie de hârtie de turnesol. La un rezultat pozitiv transformă hârtia în albastru.

Formarea indolului și a H2S. De obicei, pentru a determina capacitatea de a forma indol și hidrogen sulfurat, semănatul se efectuează și în BCH, hârtiile sunt fixate între suprafața sa și plută: în primul caz, impregnate cu o soluție de acid oxalic (când se formează indol, hârtia devine roșie), în al doilea - cu o soluție de acetat de plumb (când se formează H 2 S hârtia devine neagră).De asemenea, se folosesc medii speciale care conțin indicatori (de exemplu, mediul Kligler), sau se adaugă direct la mediu după înregistrarea creșterii bacteriene vizibile.

Test pentru activitatea nitrat reductazei

Acest test este utilizat pentru a identifica tipuri individuale de bacterii. Vă permite să determinați capacitatea de a restabili nitratul în nitriți. Capacitatea de a reduce NO3 la NO2 este determinată prin cultivarea în BCH care conține 1% soluție de KNO3. Pentru a determina nitrit, se adaugă câteva picături de reactiv Griess în mediu. Cu un rezultat pozitiv, se observă apariția unui inel roșu.

Cromatografia

Metodele cromatografice sunt utilizate pentru identificarea bacteriilor și stabilirea poziției lor sistematice. Obiecte pentru cercetare - acid gras perete celular, intermediari unici și metaboliți finali ai activității vitale a bacteriilor. Sistemele cromatografice sunt de obicei interfațate cu computere, ceea ce simplifică foarte mult contabilitatea rezultatelor. Cea mai comună identificare a acizilor grași cu lanț scurt și a acizilor teicoici este prin cromatografia gaz-lichid. cromatografie lichidă sub presiune ridicata identifica acidul micolic în pereții celulari ai micobacteriilor. Cromatografia în strat subțire este utilizată pentru a identifica chinonele izoprenoide ale peretelui celular bacterian. În diferite genuri, conținutul și setul lor sunt diferite, dar constante, ceea ce face posibilă stabilirea poziției sistematice a fiecărei specii specifice.

hârtii indicatoare

Pentru a studia activitatea biochimică a bacteriilor, sunt utilizate pe scară largă sisteme de hârtii indicator sau seturi de multimicroteste.

Sistemul de documente indicatoare (SIB)- un set de discuri impregnate cu diverse substraturi. Ele pot fi introduse direct în eprubete cu suspensie de bacterii sau introduse în prealabil în godeurile plăcilor de plastic, unde se vor introduce bacteriile studiate. Deci, în practică, se folosesc kiturile Minitek Enterobacteriaceaeși Minitek Neisseria pentru diagnostic diferentiat Enterobacteriile (paisprezece substraturi) și Neisseria (patru substraturi), permițând obținerea rezultatelor după 4 ore de incubare la 37 °C.

Suite de testare multimicro- plăci de plastic, în puțurile cărora sunt amplasate diverse substraturi și indicatori. În godeuri sunt adăugate diferite diluții de bacterii și incubate la 37°C. În practică, testele RapID NH sunt folosite pentru a identifica Neisseria și Haemophilus, RapID E pentru enterobacterii etc., permițându-vă să obțineți rezultate în cel mult 4-8 ore.

Sisteme automate de identificare a bacteriilor

Sistemele automate de identificare a bacteriilor vă permit să obțineți rapid (cu 24-48 de ore mai rapid decât metodele convenționale) informații despre tipul de agent patogen și sensibilitatea acestuia la medicamentele antimicrobiene. În prezent, sistemele de tip Microscan și Vitek sunt cele mai utilizate pe scară largă.

Sisteme de microscanare. Utilizați metode turbidimetrice, colorimetrice și fluorescente pentru identificarea bacteriilor. Sistemele constau din seturi de plăci de plastic care conțin diferite substraturi. Bacteriile gram-pozitive și gram-negative sunt diferențiate folosind substraturi fluorescente (timp de analiză - 2 ore). Pentru identificarea hemofililor, anaerobilor și drojdiilor se folosesc substraturi cromogene care își schimbă culoarea (timpul de analiză este de 4-6 ore). Concentrațiile minime inhibitorii ale diferitelor antibiotice sunt determinate de modificarea densității optice. Sistemul este computerizat și realizează automat toate calculele necesare.
sisteme Vitek. Acest sistem folosește un tip de plăci cu treizeci de godeuri. O suspensie de bacterii cu o concentrație cunoscută de corpuri microbiene este adăugată automat în fiecare godeu. Identificarea microorganismelor (hemofile, neisseria, drojdii și anaerobi) se bazează pe turbidometria mediului de reacție din sondă. In functie de proprietatile microorganismului, timpul necesar pentru identificarea acestuia variaza de la 4-8 la 18 ore.Sistemul este complet computerizat si functioneaza automat.

Metode de identificare a acidului nucleic

Metodele de detectare a ARN-ului și ADN-ului agenților patogeni și-au găsit aplicație în principal în diagnosticul infecțiilor virale. Cu toate acestea, au fost dezvoltate sisteme de testare pentru identificarea unor bacterii pretențioase (de exemplu, legionella, chlamydia), precum și pentru identificarea coloniilor. Neisseha gonorrhoeae, Haemophilus influenzae streptococi de tip b, grup B, enterococi și micobacterii.

Hibridarea acizilor nucleici

Cele mai comune metode de hibridizare a acizilor nucleici. Principiul metodelor se datorează capacității ADN-ului (și ARN-ului) de a se combina (hibrida) în mod specific cu fragmente complementare ale catenelor de ADN (și ARN) create artificial, marcate cu izotopi sau enzime (peroxidază sau fosfatază alcalină). În viitor, probele sunt examinate prin diferite metode (de exemplu, ELISA).

Metoda de hibridizare a soluției oferă cele mai rapide rezultate. Problema eliminării catenelor nelegate de acizi nucleici împiedică implementarea pe scară largă a metodei.

Metoda de hibridizare pe baze solide iar modificarea lui sandwich este mai frecventă. Membranele din nitroceluloză sau nailon servesc drept bază solidă. Reactivii nelegați sunt îndepărtați prin spălare repetată.

Identificarea biochimică a bacteriilor folosind sisteme de testare

Alte variante ale unor astfel de sisteme de testare asigură adsorbția substraturilor diferențiate pe suporturi de hârtie sau polimeri. Printre acestea, sunt comune sistemele Auxtab, Minitek, Morlok, MICRO-ID.

Astfel de sisteme sunt convenabile de utilizat, vă permit să explorați simultan gamă largă semnele microbiene, întotdeauna gata de utilizare în orice laboratoare microbiologice, sunt simple și de încredere, necesită volume mici de inocul, prin urmare economisesc sticlă de laborator, pipete. Prelucrarea computerizată a rezultatelor obținute face posibilă determinarea și evaluarea rapidă a tipului de agent patogen necunoscut.

Producția de medii nutritive. Toate mediile conțin predominant animale naturale sau produse din planteși componente - carne, făină de pește, ouă, lapte, sânge, extract de drojdie, cartofi și altele asemenea. Din ele se prepară semifabricate speciale sub formă de extracte, infuzii, hidrolizate enzimatice și acide (apă de carne, extract de drojdie, hidrolizat triptic Hottinger, peptonă și altele), care stau la baza proiectării ulterioare a mediilor nutritive. În plus, în mediile nutritive se adaugă diverse săruri anorganice, în funcție de nevoile celulei microbiene. De regulă, concentrația de clorură de sodiu este de 5,0 g / l, KH2PO4 - 0,2-0,5 g / l, MgSO4 7H2O, alte săruri se adaugă la o rată de 0,001 g / l. În cazurile necesare, în compoziție se adaugă carbohidrați (zaharuri, alcooli polihidrați), aminoacizi în concentrație de 0,5-1,0%, precum și vitamine (până la 0,001 mg / ml).

Pentru a asigura densitatea necesară a mediului se folosește agar-agar, care se obține din alge marine. Este o componentă convenabilă și necesară a mediului, deoarece nu este consumată de bacterii ca substrat de creștere. Formând un gel în apă, se topește la o temperatură de aproximativ 100 ° C și se îngroașă la 40 ° C. Sursa de gelatină este substraturile bogate în colagen. Printre acestea se numără cartilajele, tendoanele, oasele și altele asemenea. Gelul, care este obținut ca urmare a utilizării gelatinei, se topește la o temperatură de aproximativ 32-34 ° C și se solidifică la 28 ° C. Cu toate acestea, numeroase microorganisme sunt capabile să descompună gelatina, astfel încât utilizarea acesteia din urmă ca umplutură medie este considerată inadecvată. Cel mai adesea, astfel de medii cu gelatină sunt folosite pentru a determina proprietățile proteolitice ale bacteriilor.

Producția de medii nutritive este un proces dinamic complex care necesită atenția unui bacteriolog. Acest proces constă din mai multe etape principale. În primul rând, componentele uscate necesare ale mediului sunt adăugate în apă distilată conform prescripției, bine amestecate, dizolvându-se la încălzire. Asigurați-vă că setați pH-ul mediului, care este determinat fie folosind un ionometru, fie hârtii indicator. În acest caz, trebuie menționat că, după sterilizare, reacția mediului scade cu 0,2. Mediile care conțin agar sunt filtrate printr-un filtru din tifon de bumbac în stare fierbinte, mediile lichide prin filtre de hârtie. La nevoie se limpezesc prin precipitare sau cu ajutorul albusului de ou sau al zerului. Mediile sunt turnate în saltele speciale, baloane, flacoane și închise cu dopuri din tifon de bumbac cu capace de hârtie. În funcție de compoziția mediului, se folosesc diferite moduri de sterilizare. Da, mediile care conțin carbohidrați, gelatina sunt sterilizate într-o autoclavă timp de 15 minute la o temperatură de 112 ° C sau cu un vapori fluid la o temperatură de 100 ° C fracționat. Mediile fără carbohidrați pot fi sterilizate într-o autoclavă la 115-120°C timp de 20 de minute. Dacă compoziția mediului include componente instabile la temperatură, cum ar fi proteine ​​native, zer, uree, atunci acestea sunt sterilizate fie prin filtrare prin filtre bacteriene, fie sunt adăugate gata în mediul steril. Sterilitatea mediului este controlată prin vitrificarea acestora într-un termostat timp de câteva zile la o temperatură de 37 °C.

Dăm exemple de fabricare a unor medii nutritive simple, care sunt cel mai des folosite în practica microbiologică și pot sta la baza fabricării altora mai complexe.

apa de carne. Pentru fabricarea ei se folosește carne de vită proaspătă, care este curățată în prealabil de grăsime, fascie, tendoane și altele asemenea, tăiată în bucăți mici și trecută printr-o mașină de tocat carne. Carnea tocată rezultată se toarnă cu apă de la robinet într-un raport de 1: 2, se amestecă și se lasă o zi într-un loc răcoros. Infuzia rezultată se fierbe timp de 30-60 de minute, îndepărtând periodic depunerile, apoi apără. Lichidul este separat de carnea tocată, filtrat prin hârtie de filtru sau pânză și completat cu apă de la robinet până la volumul primar, apoi turnat în flacoane și sterilizat la 1 atmosferă (temperatura 120 ° C) timp de 30 de minute. Apa sterilă din carne este transparentă, are o culoare gălbuie, iar pe pereții sticlei și la fund există un precipitat de proteine ​​care s-au coagulat. Prin urmare, în timpul utilizării ulterioare a mediului, acesta este filtrat din nou. Reacția activă a mediului este 6,2.

Bulion de carne-peptonă (MPB). Pentru a face BCH, se adaugă 1% peptonă și 0,5% clorură de sodiu în apa din carne, pH-ul necesar este ajustat cu o soluție de NAOH 20% și se fierbe timp de 30-40 de minute, amestecând constant. Bulionul se filtrează prin filtre de hârtie sau de in, se toarnă în sticle, eprubete, se verifică reacția activă a mediului și se sterilizează la 120 °C timp de 20 de minute.

M'yaso-peptonniagar (MPA). La bulionul de carne-peptonă se adaugă agar-agar tocat fin (2-2,5%). Amestecul rezultat este fiert pentru a dizolva agar-agar, filtrat, pH-ul ajustat și turnat în flacoane. Sterilizarea se efectuează timp de 20 de minute la o temperatură de 120 °C.

Medii cu sânge, ser sau lichid ascitic. Deoarece aceste medii nu pot fi stocate pentru o perioadă lungă de timp, ele sunt pregătite imediat înainte de utilizare. Pentru a face acest lucru, adăugați steril 5-10% sânge proaspăt sau defibrinat al unui berbec, iepure sau alt animal la topit și răcit la 45-50 ° C MPA. Flacoanele cu agar sunt bine amestecate și turnate în vase Petri, asigurându-vă că nu există spumă.

Ser (5-10% ser) sau agar ascitic (25% lichid ascitic) se prepară identic.

Triptychniydig pentru Hottinger. Bulionul din acesta este mai economic decât alte medii de peptonă de carne, deoarece vă permite să obțineți de câteva ori mai mult bulion dintr-o porție de carne. Acest mediu conține o cantitate mare de aminoacizi, prin urmare, capacitatea sa de tamponare crește, iar din acest motiv, valoarea reacției active a mediului este mai stabilă.

Pentru a face un digerat, se ia un kilogram de carne fără tendoane și grăsime, se taie în bucăți mici de până la 1-2 cm, se scufundă într-o oală cu un volum dublu de apă, care fierbe, și se fierbe 15-20 de minute până carnea devine gri, ceea ce indică coagularea proteinelor. Se scoate din lichid și se trece printr-o mașină de tocat carne. În lichidul care rămâne, pH-ul este setat la 8,0, carnea tocată este coborâtă acolo și răcită la 40 ° C. Se adaugă apoi 10% (la volumul de lichid) pancreas proaspăt, curățat în prealabil de țesut conjunctiv, grăsime și trecut printr-o mașină de tocat carne de două ori. În locul unei glande, se folosește un preparat uscat de pancreatină (0,5%). Amestecul rezultat este agitat bine și pH-ul este ajustat la 7,8-8,0. După 30 de minute, verificați pH-ul. Dacă reacția activă a mediului nu se schimbă în partea acidă, aceasta indică calitatea proastă a enzimei. Când pH-ul mediului se stabilizează, amestecul se toarnă în sticle mari, umplându-le 1/3. Adăugați până la 3% cloroform, închideți vasele cu dopuri de cauciuc și agitați puternic pentru a amesteca lichidele. Se eliberează excesul de vapori de cloroform. După 1-2 ani, pH-ul mediului este din nou verificat, punându-l la 7,4-7,6.

Adăugați material

Amestecul rezultat este lăsat la temperatura camerei timp de până la 16 zile. În primele 3-4 zile se verifică și se reglează zilnic pH-ul mediului, iar flacoanele se agită de nu mai puțin de 3 ori pe zi. Mai târziu, această procedură poate fi omisă și mediul nu trebuie agitat la fel de des. Cu 1-2 zile înainte de sfârșitul ciclului de digestie se oprește agitarea mediului.

Digestia finalizată de înaltă calitate este evidențiată de clarificarea lichidului, care capătă o culoare galben-pai, precum și de formarea unui sediment prăfuit la fund. Lichidul se filtrează ușor, se verifică prezența triptofanului folosind o probă cu apă cu brom (la 3-4 ml de filtrat se adaugă 3-4 picături de apă cu brom). În prezența triptofanului (până la 2,0-3,0 g/l), culoarea mediului se schimbă în roz-violet. Se determină azotul total, care în mod normal ajunge la 11,0-12,0 g/l, și azotul aminic (până la 7,0-9,0 g/l).

Hidrolizatul este filtrat printr-un filtru de hârtie sau in, îmbuteliat și autoclavat la 120°C timp de 30 de minute. În această formă, poate fi păstrat pentru o lungă perioadă de timp.

Se folosește la prepararea bulionului Hottinger. În acest scop, se adaugă până la 100-200 ml de hidrolizat, 800-900 ml apă distilată, clorură de sodiu 0,5% și fosfat de sodiu monosubstituit 0,2%. pH-ul este ajustat la 7,4-7,6, turnat în flacoane și sterilizat timp de 20 de minute la 120 °C.

Agarul Meat-pepton pe bază de hidrolizat de Hottinger se prepară după rețeta MPA obișnuită.

Astăzi, de regulă, bacteriologii încearcă să folosească medii de cultură uscate standard care sunt produse de industria bacteriologică. Astfel de medii pot îmbunătăți semnificativ rezultatele studiilor microbiologice și le pot standardiza.

Pentru cultivarea bacteriilor, mediile fără proteine ​​sunt utilizate pe scară largă, în care multe specii de bacterii organotrofe, inclusiv patogene, cresc bine. Aceste medii includ multe componente.

Cultivarea în medii sintetice folosind metoda atomilor marcați face posibilă diferențierea mai detaliată a bacteriilor în funcție de natura biosintezei lor.

Pentru diferențierea bacteriilor prototrofe și auxotrofe sunt utilizate pe scară largă medii selective.

Prototrofele cresc într-un mediu minim care conține doar săruri și carbohidrați, deoarece ei înșiși pot sintetiza metaboliții de care au nevoie pentru dezvoltare, în timp ce auxotrofii au nevoie de un mediu care conține anumiți aminoacizi, vitamine și alte substanțe.

Pe medii nutritive dense, bacteriile se formează diferite ca formă și dimensiune colonii- acumulări vizibile de microorganisme din aceeași specie, care se formează ca urmare a reproducerii din una sau mai multe celule. Coloniile sunt plate, convexe, bombate, deprimate, suprafața lor este netedă (în formă de S), aspre (în formă de R), striate, tuberculate, marginile sunt uniforme, zimțate, fibroase, franjuri. Forma coloniilor este, de asemenea, diversă: rotundă, în formă de rozetă, stelate, asemănătoare copacului. După mărime (diametru), coloniile sunt împărțite în mari (4-5 mm), medii (2-4 mm), mici (1-2 mm) și pitice (mai puțin de 1 mm).

Sub denumirea colectivă „salmoneloză” se combină bolile care sunt cauzate în principal de bacteriile din gen Salmonellași apar de obicei cu simptome de septicemie sau cu evoluție subacută, uneori cronică și inflamație tract gastrointestinal, leziuni ale ficatului, organelor respiratorii, articulațiilor sau avorturi la femei.

Salmoneloza este o boală a animalelor de fermă de toate felurile, păsărilor, animalelor cu blană și faunei sălbatice. La animalele tinere cu vârsta cuprinsă între 10 zile și 4 luni, boala este acută, în formă septică, însoțită de creșterea temperaturii corpului, enterită, bronhopneumonie, artrită și paralizie. La animalele adulte se notează bacteriopurtător, avort, perioade de exacerbare.

La om, infecțiile toxice sunt cauzate de salmonela adaptată corpului animalelor și păsărilor.

Din anii 1980 diferite boli ale animalelor legate de salmoneloză au fost descrise sub diferite denumiri. În 1885, Somonul a izolat primul agent cauzal al salmonelozei într-o cultură pură. S. chol-erae(fostul nume S. suipestifer), care a fost mult timp considerat agentul cauzator al pestei porcine. Schotmuller în 1890 a numit paratifoidă o boală a oamenilor, ai căror agenți cauzali sunt S. paratiphy A și B, deoarece simptomele bolii sunt similare cu febra tifoidă. Ulterior, bolile animale în masă cauzate de similare S. paratiphy bacterii, numite și paratifoide. Cu toate acestea, acest nume a devenit învechit și a fost înlocuit. Pfeiffer, Müller și Bitter au descoperit asta S. paratiphy A și B sunt patogeni doar pentru oameni, în timp ce speciile și soiurile izolate de la animale și păsări provoacă infecții toxice la om.

Salmonella din cea mai recentă ediție a cheii concise pentru bacterii a lui Bergi sunt atribuite familiei enterobacteriacee, trib Escherichiaee, genul Salmonella, familie Enterobacteriaceaeși includ 12 genuri: Escherichia, Edwardsiella, Citrobarter, Salmonella, Shigella, Klebsiella, Enterobacter, Hafnia, Serratia, Proteus, Erwinia, Jersinia. Genul Salmonella include 65 de grupuri (mai mult de 2000 de serovari). Comitetul pentru Nomenclatură Internațională împarte genul Salmonella în patru subgenuri (Tabelul 15.1):

1. S. kauffmanni. Include majoritatea Salmonella patogene pentru om, grupele serologice A, B, C, D, E.

Tabelul 15.1

Diferențierea biochimică a salmonelozei

Convenții: n--pozitiv;--negativ; P - diferit;

• (+) - târziu, dar întotdeauna pozitiv; x - târziu, dar nu întotdeauna pozitiv
• 2. S. salamae. Diferă de primul subgen prin capacitatea de a lichefia gelatina și de a fermenta malonita de sodiu.
• 3. S. arizonae. Fermentează lactoza, găsită la păsări, reptile, mamifere; în anul trecut găsit la oameni în stări febrile cu simptome de diaree și gastroenterită.
• 4. S. houtenau. Au fost atribuite Salmonella atipice din punct de vedere biochimic.

Caracteristicile culturale și biochimice generale ale reprezentanților genului Salmonella (cu câteva excepții) fac posibilă deosebirea acestora de alte grupuri ale familiei Enterobacteriaceae și grupuri similare. (Edwardsiellași Citrobacter).

Pentru identificarea biochimică Citrobacter și din patru subgenuri de Salmonella, cinci teste sunt utilizate în practică: prezența gelatinazei, utilizarea liziei, lactozei, glicerolului și decarboxilării lizinei.

Kaufman a împărțit genul Salmonella în patru subgenuri în funcție de structura lor antigenică (Tabelul 15.2).

Structura antigenică a salmonelei

Grup și specie (serovar)		Structura antigenică
	Antigenul somatic	Antigenul flagelului
		faza specifica	Faza nespecifica
S. paratyphi A
S. typhimurium
S. abortus-equi
S. abortus-ovis
S.paratyphi B
S. abortus bovis
S. cholerae-suis
S. typhi-suis
S. enteritidis
S. dublin
S. rastoc
S. gallinarum
S. pullorum

proprietăți biologice. Bacteriile din familia Salmonella au următoarele proprietăți generale: sunt gram-negative, nu formează spori, lipsesc oxidază, reduc nitrații la nitriți, fermentează glucoza, cresc bine pe medii obișnuite, anaerobi facultativi.

Morfologie. Acestea sunt tije mici cu capete răsucite, I-3 lungime și 0,5-0,8 microni în diametru, de regulă, mobile, cu excepția S. gallinarumși S. rillorum. Printre alte specii se găsesc mutanți nemotili. Nu formează capsule. Coloniile lor au un diametru de 2-4 mm. Pe MPA - transparent, fraged, albăstrui; pe mediu Endo - roz, transparent; pe mediu Ploskirev - incolor; pe mediu Levin - transparent cu o tentă violetă;

Proprietăți enzimatice sunt diverse nu numai într-un subgen, ci pot varia în cadrul aceluiași serovar. Salmonella formează hidrogen sulfurat și nu formează indol, nu fermentează lactoza și salicină, utilizează citrat, fermentează glucoza și maniitul. În cele mai recente studii științifice, Salmonella se diferențiază prin 26 de teste biochimice.

Durabilitate. Endotoxinele Salmonella sunt de lungă durată și foarte rezistente. Efectul lor toxic nu slăbește în grosimea cărnii atunci când se gătesc bucăți mari. La o temperatură de 65-70 ° C, Salmonella supraviețuiește mult timp, nu moare într-o soluție de 8-10% de acid acetic timp de 18 ore.În sol, gunoi de grajd, așternut, Salmonella persistă câțiva ani și se poate multiplica în depozitele fecale din boxele de porci, în furaje lichide, apă, soluri fertilizate cu gunoi de grajd. Se înmulțesc în toate produsele alimentare cu umiditate și temperatură suficientă (7-45 ° C), pH de la 4,1 la 9,0. Folosit pentru dezinfecție, soluție de hidroxid de sodiu 3%, înălbitor care conține 2% clor activ, suspensie de var proaspăt stins 20%, soluție de formaldehidă 2% dezinfectează în mod fiabil încăperile cu o expunere de 1-1,5 ore.se efectuează soluri de salmonella din padocuri și pășuni. conform metodei elaborate de S.M. Gubkin (1953).

Toxigenitate. Salmonella posedă endo- și exotoxine. Endotoxinele provoacă inflamații hemoragice ale intestinelor și provoacă diaree și alte semne de boală. Exotoxinele aparțin grupului de neurotoxine. Acțiunea toxinelor este însoțită de dispepsie, enterocolită, afectarea sistemului nervos central, în timp ce temperatura corpului crește, apare scurtarea respirației, coordonarea mișcărilor este perturbată, reflexele slăbesc. În cazurile de intoxicație în creștere, la animale apar convulsii.

Structura antigenică salmonella este complexă. Au mai multe antigene: O, H, VI, M și K. O-antigenul este termostabil (rezistă la fierbere timp de 2,5 ore), este inhibat de formol, este situat la suprafața celulei și este format din complexe polizaharide fosfolipide. Specificitatea antigenului O în reacțiile serologice se datorează prezenței anumitor poliozide în acesta, adică. zaharuri dideoxihexoze situate la capetele lanțurilor polizaharide. Variantele serologice ale Salmonella pentru antigenul O sunt desemnate cu cifre arabe.

Una dintre componentele antigenului somatic este antigenul Yi, care aparține antigenelor K. După descoperirea Uantigenului (Felix și Ritt, 1934), a fost numit antigen de virulență. Dar nu servește, așa cum s-a dovedit acum, ca purtător direct al virulenței. Prezența sa pe suprafața unei celule microbiene împiedică aglutinabilitatea bacteriilor din O-ser, ceea ce face dificilă diferențierea Salmonella. Uantigenul este un polimer, este termolabil.

Uantigenul este o substanță labilă; dispare atunci când microbii sunt crescuți în medii nutritive atunci când li se adaugă fenol, precum și la temperaturi scăzute (20 °C) sau ridicate (40 °C), este complet distrus prin fierbere și sub acțiunea fenolului, se modifică parțial la expunerea la formol și la o temperatură de 60 °C timp de 30 de minute.

Antigenul H flagel este eterogen; constă din două faze: prima, sau faza specifică, care este aglutinată de ser specific speciei, și a doua, sau faza nespecifică, care este aglutinată nu numai de specii, ci și de ser de grup. Salmoneloza, având două faze ale antigenului H, se numește bifazică, spre deosebire de monofazică, având doar un antigen H specific. Antigenul H este termolabil, rezistent la formol, sensibil la acizi și alcool și este o proteină prin natură.

Structura antigenică a Salmonella este supusă variabilității. Complexele lor antigenice sunt supuse unor variații bruște în timpul tranziției de la forma S la forma R, precum și ca rezultat al transducției, conversiei lizogenice și conjugării.

Există mai multe tipuri de disociere a salmonelei:

• 1) Variațiile H-O, adică trecerea de la forma flagelata la forma neflagelata;
• 2) I.-, 8-variante, i.e. trecerea de la neted la aspru. Într-o soluție izotonă de clorură de sodiu, formele 11 dau un aglutinat instabil, în timp ce formele B rămân în suspensie.
• 3) Variațiile U-U se aplică numai pentru Uantigen. Forma Y conține Uantigen și este O-neaglutinabilă. Forma Y nu conține Uantigen și este considerată O-aglutinabilă. Există forme intermediare.

În practica diferențierii serologice a Salmonella, în ciuda variabilității structurii lor antigenice, sunt luați în considerare doar trei antigeni principali (O, H, VI).

Când se caracterizează proprietățile Salmonella, nu se poate să nu se oprească asupra așa-numitei lor plasticități genetice, asupra relației dintre acestea din urmă în aceste microorganisme cu multiplicitatea serovariilor lor și asupra întrebării în ce măsură această plasticitate genetică poate afecta. posibilitatea identificării lor exacte.

Salmonella a fost frecvent aleasă ca model pentru cercetarea genetică în ultimii ani. Variația naturală a structurilor antigenice ale bacteriilor a fost deja menționată. Există, de asemenea, variații cunoscute care au apărut sub influența bacteriofagelor și a altor factori. Trei mecanisme de recombinare genetică găsite în Salmonella au fost denumite mai sus. Fenomenul de transducție în Salmonella a fost descris în 1952 de Zinder și Ledenberg. În același timp, bacteriofagul temperat PT22, acționând asupra diferitelor serovare, ar putea transduce antigenul H și celelalte proprietăți ale acestuia. Pe baza acestui fapt, autorii nu exclud posibilitatea unor astfel de modificări ale microorganismului în condiții naturale.

În timpul conversiei lizogene, genele bacteriofagelor transferă funcția ca parte a celulei bacteriene. Starea lizogenă cauzată de fagul de conversie duce la o modificare a antigenelor O. În acest caz, antigenul O nou dobândit este păstrat atâta timp cât microbul rămâne lizogen.

Conjugarea are ca rezultat hibrizi cu noi proprietăți antigenice. Conjugarea poate avea ca rezultat transferul de plasmide și apariția unui factor de rezistență (factor R) sau a unei noi proprietăți. Problema modernității este distribuția largă a formelor de Salmonella care sunt polirezistente la substanțele medicinale.

Din cele de mai sus, sunt clare problemele și dificultățile de identificare a Salmonella, necesitatea unei determinări sistematice a serovariilor din culturi izolate, studiul rezistenței acestora la antibiotice și depășirea acesteia.

Pentru tipizarea serologică a tulpinilor izolate de Salmonella, analiza receptorilor este utilizată folosind seruri specifice de Salmonella aglutinante, atât de grup, cât și de specie.

Imunitate Este de natură antiinfecțioasă și antitoxică. De regulă, apare mai întâi imunitatea nesterilă, care ulterior poate deveni sterilă. Imunitatea apare adesea ca urmare a unei infecții latente. O astfel de imunitate se numește depresie.

Prima doză de antigen este esențială în crearea imunității. O doză excesivă determină suprimarea forțelor imune ale organismului, în special la animalele tinere. Dozele mici sunt de obicei neutralizate de organism și, prin urmare, nu induc imunitatea. Unii autori consideră că 2 ml de corpuri microbiene este doza optimă de imunizare.

Pentru formarea imunității stabile, este necesar un anumit grad și durata acțiunii antigenice (persistența bacteriilor vii în țesuturi). În acest sens, vaccinările în perioada postnatală timpurie nu dau efectul dorit, precum și combinarea imunizării cu utilizarea terapiei cu antibiotice. O-antigenul este considerat a fi principalul antigen în imunogeneză. În primele etape de formare a imunității se formează 1 2 M și 1 2 0. Sub influența vaccinurilor vii, începând din săptămâna a 2-a, se formează anticorpi și se intensifică reacția fagocitară, care ajung la maxim în a 5-a-6-a. săptămână.

Patogeneza. Durata perioadei de incubație depinde de metoda de infecție, de doza și de virulența agentului patogen și de starea imunitară a organismului. În condiții naturale, durata perioadei de incubație la animalele tinere din diferite specii de animale variază de la 2-5 la 10-25 de zile. Pe calea alimentară de infecție, agentul patogen pătrunde rapid în aparatul limfatic al peretelui intestinal și de acolo în circulația limfatică și sanguină. Peticele lui Peyer și foliculii solitari cresc, proeminente clar sub mucoasă, formând elevații.

Manualul este format din șapte părți. Partea întâi - „Microbiologie generală” - conține informații despre morfologia și fiziologia bacteriilor. Partea a doua este dedicată geneticii bacteriilor. A treia parte - „Microflora biosferei” - ia în considerare microflora mediului, rolul său în ciclul substanțelor din natură, precum și microflora umană și semnificația acesteia. Partea a patra - „Doctrina infecției” - este dedicată proprietăților patogene ale microorganismelor, rolul lor în procesul infecțios și conține, de asemenea, informații despre antibiotice și mecanismele lor de acțiune. Partea a cincea – „Doctrina imunității” – conține idei moderne despre imunitate. Partea a șasea - „Virușii și bolile pe care le provoacă” - oferă informații despre principalele proprietăți biologice ale virușilor și despre bolile pe care le provoacă. Partea a șaptea - „Microbiologie medicală privată” - conține informații despre morfologia, fiziologia, proprietățile patogene ale agenților patogeni ai multor boli infecțioase, precum și metodele moderne de diagnosticare, prevenire și terapie specifice ale acestora.

Manualul este destinat studenților, absolvenților și profesorilor de medicină superioară institutii de invatamant, universități, microbiologi de toate specialitățile și practicieni.

Ediția a V-a, revizuită și mărită

Profilaxia specifică nu este utilizat, deși au fost propuse diferite vaccinuri din tulpini ucise și vii (mutante). S. typhimurium.