при условия in vitro. Ключов етап от размножаването на растенията IN VITRO

ВКОРЕНЕНЕТО Е КЛЮЧОВ ЕТАП В РАСТИТЕЛНОТО ПРОИЗВОДСТВО IN VITRO

В И. ДЕМЕНКО, К.А. ШЕСИБРАТОВ, В.Г. ЛЕБЕДЕВ

(катедра по овощарство)

сп. Известия ТША, бр.1, 2010г

Статията представя резултатите от дългогодишни изследвания върху влиянието на различни растежни регулатори, въглехидрати, продължителност на пасажа, качество на агара, структура на средата, солевия състав на хранителната среда върху образуването на корени. Обсъждат се етапите на ризогенезата и тяхната продължителност. Особено внимание се отделя на проблема с етиолацията, физическите фактори, хормоналния и солевия състав на хранителната среда. Съдържа важна и достоверна информация за влиянието на светлината, състава на околната среда върху ризогенезата, жизнената активност на растенията и нестерилните условия.

Ключови думи: инвитро, регулатори на растежа, хранителна среда, ювенил, етиолация, въглехидрати, ягода, ябълка, круша, люляк, роза, китайска актинидия, обикновена ясен.

Процесът на образуване на корени е поредица от различни биохимични, физиологични и хистологични събития. Близостта до съдовите тъкани предразполага клетките да отлагат коренови примордии. Местоположението на корените влияе върху жизнеспособността на вкоренените растения, особено получени in vitro. Възможно е да се получи 100% ин витро вкореняване и 100% смърт на растенията при нестерилни условия. При всякакви методи на вкореняване процесът на образуване на случайни корени преминава през 3-4 етапа: индукция, иницииране, поява на корени извън стъблената част на резника. Продължителността на първите два етапа е 10-15 дни, през този период предкомпетентните клетки придобиват способността да регенерират меристематични огнища и в тях започва синтеза на коренно-специфични протеини. Появата на корените зависи от генома на растението и условията на вкореняване.

Една от характеристиките на ин витро размножаването на растенията е ювенилизацията на тъканите, което е причината за лекотата на ин витро ризогенезата. Степента на неговото проявление зависи от условията на отглеждане и преди всичко от съдържанието на етилен в съдовете.

Предпоставка за началото на образуването на корени при всеки метод на размножаване е етиолацията. Причината за влиянието на това явление е свързана с анатомични и биохимични промени, както и ювенилизация на тъканите. В етиолирани резници са изолирани рецепторни протеини с висок афинитет към ауксин. На тъмно по-голямата част от ауксина се свързва с протеини. Етиолирането повишава активността на пероксидазата, IAA - оксидазата в тъканите, което ускорява началото на образуването на корени. Той повишава чувствителността на тъканите към екзогенен ауксин, което прави възможно използването на по-ниски концентрации. Естеството на действието на етиолацията in vitro зависи от вида на растението и има удължаващ ефект. Вкореняването in vitro се случва, когато целият изрез е осветен, което засяга ризогенезата и може да бъде частично изравнено от IBA, което стимулира синтеза на етилен в по-малка степен в сравнение с IAA. Основният проблем на успешната in vitro ризогенеза се крие в трудността да се отдели моментът на иницииране на първите коренови примордии от началото на синтеза на етилен. В същото време много високи или много ниски нива на етилен влияят негативно на вкореняването. Светлината изпълнява важна роляв регулирането на морфогенетичните процеси. Облъчването на вече образувани корени със светлина потиска удължаването на корена с 40-50%, поради 4-кратно увеличение на съдържанието на етилен. За видове, които са трудни за вкореняване, се препоръчва използването на тъмен период в началния етап на вкореняване. Продължителността му зависи от културата и варира от 3~5 дни до 4 седмици. Редица автори отбелязват сложната зависимост на вкореняването от светлинния режим, регулаторите на растежа и pH на средата. Положителният ефект от етиолацията на етапа на пролиферация на леторастите зависи от сорта. Използването на ауксини и тъмнина през последната седмица от пролиферацията на издънките на M27 намали вкореняването с 65%.

Действието на ензимните системи, които катализират разрушаването на IAA, се осъществява само в присъствието на кислород. Хранителните среди, използвани за вкореняване на издънки in vitro, съдържат много малко кислород, което не насърчава развитието на кореновите косми.

Следователно подходите за вкореняване in vitro трябва да се различават от вкореняването in vivo. Съвременното индустриално възпроизвеждане на растения in vitro е невъзможно без използването на регулатори на растежа. По правило аналозите на IAA се използват за вкореняване. Отношението към екзогенния ауксин, времето и метода на неговото използване in vitro е нееднозначно. Достатъчен брой установени корени и добра степен на оцеляване на растенията при нестерилни условия бяха получени чрез излагане в продължение на 7 дни върху среда с ауксин. По-продължителното излагане води до образуване на калус. Издънките на лесно вкоренени култури могат да се вкореняват върху среда без ауксини. Въпреки това, ауксините често не са ограничаващ фактор за видовете, които са трудни за вкореняване.

В допълнение към веществата от групата на ауксините се отбелязва стимулиращият ефект на ретардантите върху вкореняването и естеството на развитието на корена. Някои от тях активират транспорта на IAA и въглехидрати към базалната част на резника. Техниката на вкореняване in vitro дава възможност да се контролират физическите фактори, хормоналния и солевия състав на хранителната среда. В същото време, осветяване на основата на леторастите, продължително излагане на ауксин, хетерогенност на леторастите, незначителен затворен обем, отсъствие или недостатъчно интензивен газообмен, неговата специфичност, недостатъчно съдържание на кислород в зоната на вкореняване, възможна латентна стъкловидност на издънки, липсата на транспирация, фотосинтезата и излагането на ултравиолетово лъчение създават проблеми за вкореняването и последващото оцеляване на растенията в нестерилни условия. Оптимизирането на тези фактори и техните взаимодействия е основната цел на in vitro изследванията на ризогенезата. В по-голямата част от експериментите за вкореняване in vitro изследователите отбелязват значението на осмотичния потенциал на средата, който зависи от концентрацията на захарозата, състава на солта, особено азота и калия. По правило минералният състав на M.S. намален 2-8 пъти или заменен със среда на Уайт. В този случай водеща роля се дава на съдържанието на нитрат и амонячен азот. Липсата на една или друга форма на азот се отразява негативно на вкореняването на леторастите.

Издънки на овощни култури, подходящи за вкореняване, се образуват само след продължително отглеждане. Още на 11-14-ия пасаж вкореняването на трудно вкореними растителни видове е сериозен проблем. Много дългото преминаване обаче е нежелателно, особено за видове, чието вегетативно потомство е предназначено за многогодишни насаждения.

Счита се за обещаващо за вкореняване на издънки, получени in vitro в стерилни субстрати при висока влажност или в атмосфера на изкуствена мъгла. Относно способността за вкореняване in vitro в научната литература са представени широк спектър от данни - от лесно вкоренени видове (ягода) до без вкореняване (каларска круша). Следователно не е изненадващо, че много автори смятат успешното установяване на издънки in vitro като ключова стъпка в микроразмножаването.

Материали и методи

Изследвана е способността за вкореняване in vitro на ягоди, ябълкови дървета, круши, люляк, рози, китайска актинидия, обикновена пепел: с помощта на различни регулатори на растежа (IAA, IMC, NAA, kultar, mival, krezatsin, натриев хумат, сребърен нитрат); въглехидрати (захароза, глюкоза, малтоза, фруктоза, сорбитол, манитол); Повърхностно активно вещество (tween-40, KEP); влиянието на продължителността на пасажа и качеството на леторастите, агара и неговите заместители, структурата на средата и въздействието на физичните фактори, солевия състав на хранителната среда. Растенията са отгледани според общоприети методикато се вземат предвид спецификите на етапа на вкореняване. Взети са предвид началото на образуването на корени, развитието на калуса, броя на корените и растежа на леторастите. Във всеки вариант по 10-14 растения в четири повторения.

Резултати и тяхното обсъждане

Способността на страничните издънки да се вкореняват in vitro до голяма степен определя ефективността на технологията за микроразмножаване. Това е най-скъпият артикул (75% от разходите за ръчен труд) в себестойността на крайния продукт. Успешното преминаване на етапа на ризогенеза зависи от културата, сорта, условията на етапа на пролиферация, солевия и хормоналния състав на средата и броя на пасажите. Само ягодовите издънки са били способни да се вкоренят в първия пасаж, а Robinia и weigela във втория пасаж. Вкореняването на ягодите зависи от състава на солта на средата и нейната форма. Средата на Fossard е най-подходяща за вкореняване на ягоди. Кореновата система на тази среда се характеризира със силен растеж, оцветена е и има странични корени. Растенията в средата на Fossord са по-развити, имат 4-5 тъмнозелени листа. Развитието на калуса липсваше. По-малко концентрираната среда намалява вкореняването и инхибира развитието на кореновата система.

сряда М.С. стимулира вкореняването и развитието на калус в основата на издънката, а наличието на калус е нежелателно, тъй като когато растенията се трансплантират в нестерилни условия, те умират от ботритис. Фузариум и Питиум. Намаляване на околната среда на M.S. макроелементите или азотът с 1/2 или 4/5 увеличават вкореняването на почти всички изследвани култури и образуването на корени настъпва при по-ниски концентрации на ауксин. Върху пълната среда MS, съдържаща 0,5 mg/l IBA, се развиват дебели, къси корени. На бедна среда корените са нишковидни и се развиват от основата на леторастите.

Естеството на развитието на кореновата система зависи от вида на регулатора на растежа, който предизвиква образуването на корени. Стимулиращият ефект на IBA и IAA при опити с ягоди е по-изразен върху твърди среди, а NUK - върху течни среди. По-мощна коренова система се формира върху течна среда, съдържаща NAA. Развитието на надземната система обаче не се осъществява, което се свързва със способността на NAA да се абсорбира и да се движи през растителните тъкани. Интензивно развитие на калуса беше отбелязано на всички медии, особено на медиите с NAA. Като се имат предвид недостатъците на ауксина на етапа на вкореняване in vitro, е необходимо да се търсят други вещества, които биха стимулирали бързото развитие на кореноустойчивост и устойчивост на суша на надземните системи. От литературни източници е известно, че такива свойства притежава сорт, който се е доказал добре върху непокътнати растения със зелени резници (Таблица 1).

С увеличаване на концентрацията на културата в средата се инхибира растежът на надземната и кореновата системи, които се характеризират с интензивен радиален растеж. Използването на култар в концентрационен диапазон 0,3-0,5 mg/l също инхибира развитието на надземната система, но в по-малка степен. Развитие на калус не се наблюдава в нито един от вариантите. Концентрацията на култа над 1 mg/l предизвиква загиване на леторастите. Вкореняването на леторастите in vitro е възможно само при определена дължина. Нито едно от тестваните вещества не насърчава развитието на корени директно от меристематичния връх, т.е. в началото е необходим разтягащ растеж, а след това започват да се развиват корени. Въвеждането на хранителна среда (0,1-0,2 mg/l) напълно инхибира растежа на меристематични върхове чрез разтягане и предизвиква развитието на кореновата им система. Някои от корените бяха боядисани зелен цвят, т.е. кореновата система поема функцията на фотосинтетичен орган при липса на растеж на надземната система. Културата в концентрация 0,5 mg/l стимулира развитието на корени от втори, а в някои случаи и от трети ред при люляци.

За да се елиминира отрицателният ефект на ауксините върху процеса на образуване на корени in vitro, бяха тествани вещества от групата на силициевите органични съединения (мивал, крезацин, CEP) и натриев хумат. Използването на мивал и крезацин значително повлия на вкореняването и развитието на кореновата система на ягоди, актинидия синенсис, круши. Оптималните концентрации на изследваните вещества са в диапазона 0,1-2 mg/l, при което се променят всички параметри на развитието на кореновата система. Процентът на вкореняване, броят на корените и тяхната дължина се увеличават (Таблица 2).

Скоростта на вкореняване на ягодовите филизи в комбинация с органосилициеви съединения с други индуктори на коренообразуване зависи от техните концентрации. Вкореняването е напълно инхибирано, ако концентрацията на mival и krezacin надвишава 2 mg/l в комбинация с IBA и когато те се въвеждат съвместно в хранителната среда.

Подобен ефект от комбинираното използване на BCI с органосилициеви съединения е отбелязан при експерименти с круша. Стимулиращият ефект на крезацин се проявява в по-тесен диапазон от концентрации (0,1-0,2 mg / l), а mival при концентрации от 0,1-0,5 mg / l.

Може да се предположи, че mival има ауксиноподобен ефект, но не стимулира развитието на калуса. При ниски концентрации на мивал и крезацин се наблюдава синергичен ефект с IMC върху процесите на растеж и развитие на ягодите in vitro - височината на растението се увеличава поради дължината на леторастите и листата.

Разделното използване на мивал и култара в ниски концентрации допринесе за 100% вкореняване на ягодите; комбинираната употреба при високи концентрации напълно инхибира образуването на корени. Actinidia sinensis, за разлика от ягодата, максимизира развитието на корени от комбинираната употреба на IBA с Mival, докато концентрацията на IBA също надвишава концентрацията на Mival. Комбинираното действие на mival и krezacin инхибира вкореняването на тази култура. Очевидно актинидията изисква по-висока концентрация на ауксин на етапа на индукция в сравнение с ягодите. Следователно високите концентрации на IBA стимулират образуването на корен на актинидия в по-голяма степен, ако се използва отделно.

Натриевият хумат и сребърният нитрат значително ускоряват преминаването на етапите на вкореняване на ягодовите издънки. Използването им в концентрация 0,5-1 mg/l намалява времето за вкореняване на леторастите, ускорява производството на растения, подходящи за разсаждане в нестерилни условия. Данните от нашите опити със сребърен нитрат и метионин ни дават основание да твърдим, че на първия етап на вкореняване значителен синтез на етилен инхибира образуването на корени. Въвеждането на метионин в хранителната среда напълно потиска ризогенезата при вариантите с IMC и Mival и значително при вариантите на комбинираното действие на индуктори на коренообразуване. Очевидно е, че метионинът повишава съдържанието на етилен във фазата на индукция на корена до инхибиращо ниво.

На всички етапи на микроразмножаване в хранителни среди се използват въглехидрати, главно захароза, като най-мобилният въглехидрат. Въглехидратите в тъканната култура са важни не само като хранителни вещества, но и като вещества, които заедно със солевия състав създават определено осмотично налягане. Стойността на въглехидратите се увеличава на етапа на вкореняване поради необходимостта от подготовка на растението за автотрофно хранене при нестерилни условия. Концентрацията на въглехидрати захароза, фруктоза, глюкоза 10 g/l е недостатъчна за вкореняване на ягоди. Манитолът и сорбитолът, които нямат хранителна стойност, но имат способността да влияят на осмотичното налягане, също не са допринесли за образуването на корени. Появата на първите корени върху издънките на пепелта се отбелязва на 9-10-ия ден след засаждането върху средата за вкореняване. Ефектът на изследваните въглехидрати зависи от използваните регулатори на растежа (Таблица 3).

Различните въглехидрати не оказват съществено влияние върху честотата на вкореняване: във варианта с NAA тя е 86–93%, а във варианта с IMC е 55–71%. Въпреки това броят на корените и тяхната дължина се различават значително: максималните стойности са отбелязани на средата с 30 g/L захароза или 10 g/L глюкоза. Корените на среда с малтоза са 2,4 пъти по-къси от тези на среда със захароза и 3,2 пъти по-къси от средата с глюкоза, докато растенията изостават от растенията на среда със захароза и глюкоза.

Растежът и развитието на корените in vitro зависят от аерацията на хранителната среда, която от своя страна зависи от концентрацията на агара. Вкореняването на леторастите в плътна среда е трудно, не се развиват корени от втори ред. С намаляване на концентрацията на агар, вкореняването на леторастите и развитието на корени от втори ред се увеличава значително.

Въпреки това, при продължително развитие на растенията върху среди с ниско съдържание на агар (1,5-2,5 g/l), те показват признаци на стъкловидност. На хранителни среди, съдържащи дори малки концентрации на агар, кореновите косми никога не се развиват, което показва недостатъчно съдържание на кислород. Като се има предвид важността на съдържанието на кислород по време на инициирането и развитието на корените и кореновите косми, бяха направени опити за замяна на агара на етапа на вкореняване. При използване на пълната среда на M.S. и заместителите на агар издънки умират в рамките на няколко дни след засаждането. Смъртта на издънки и растения, които започнаха да развиват корени на средата 1/2 M.S. и заместители на агар (перлит, пясък), се свързва с изсушаването на горния слой на субстрата.

Агарът стимулира по-ранното образуване на корени. Може би увеличава дифузията на вещества от хранителната среда, а също така подпомага дифузията на вещества от експланта, които инхибират образуването на корени. Повечето от вкоренените леторасти във вариантите със заместители на агар се вкореняват в нестерилни условия, но тогава растежът им е слаб. Комбинирането на агар с перлит води до добре развита коренова система на ягодите, което гарантира успешното установяване на растенията в нестерилни условия. Комбинацията от перлит с агар позволява да се намали концентрацията на агара с 3 пъти. След автоклавиране и втвърдяване на средата в съдовете за вкореняване се образуват два слоя: отгоре - перлит, импрегниран със средата; отдолу - агарова среда, осеяна с перлитни частици (Таблица 4).

Съотношението на перлит и хранителна среда с агар 0,5-1:1 по обем е оптимално. Използването на такава среда за вкореняване на круши не даде положителни резултати.

Съществуващият метод за вкореняване на странични издънки на голям брой видове с помощта на ауксини е възможен само след продължително преминаване. Положителният ефект върху репродукцията може да се дължи на подмладяването на растителния материал. Възможността за стимулиращ ефект на етиолацията не е изключена, тъй като с увеличаване на броя на пасажите се увеличава броят на страничните издънки, чиято основа като правило е етиолирана. Шпоровите форми на ябълковото дърво и клоновата подложка 62-396 започнаха да се вкореняват добре от 12-13 пасаж. Вкореняването им зависи от състава на солта на хранителната среда. Вкореняването на дървесни растения при по-късни пасажи създава биологични и организационни проблеми, които отчасти се решават чрез съхраняване на култури в етап на пролиферация при ниски температури. Този фактор обаче може негативни последиципри вкореняване (ефектът на етиолацията и ниските положителни температури). В тази връзка, ние изследвахме ефекта на условията на осветление върху вкореняването на страничните издънки на ябълкови дървета in vitro (Таблица 5). Резултатите от експериментите разкриват известна връзка между влиянието на светлината, ниската температура, регулаторите на растежа и вкореняването на леторастите.

При използване на IMC като индуктор на образуване на корени, вкореняването на леторастите се увеличава с 14-30%, ако пролифериращите култури са изложени на тъмнина, особено в комбинация с ниски положителни температури. Липсата на светлина на етапа на размножаване значително намалява вкореняването при варианта с култиватор и мивал, особено във варианта с култиватор. Ниските положителни температури намаляват инхибиторния ефект на етиолацията при тези варианти.

Ако индукцията на вкореняване (15 дни) се проведе при условия на етиолация, тогава вкореняването намалява с 10-64%, в зависимост от индуктора на образуване на корени. Както вече беше отбелязано, ауксините, синтезирани от експланти, играят основна роля при вкореняването. Те са необходими на етапа на индукция на образуване на корени, който продължава 6-10 дни. Липсата на светлина по време на съхранение и вкореняване стимулира образуването на корени само при наличие на IMC.

Намаляването на тъмния период до 5-10 дни увеличава скоростта на вкореняване на леторастите на подложката 62-396 с 24% при използване на IMC. Съхранението на ягодовите конгломерати при ниски положителни температури преди вкореняването на леторастите оказва влияние върху скоростта на преминаване през етапите на образуване на корени (Таблица 6).

Последствието от ниски положителни температури зависи от индуктора на образуване на корени. IMC се ускорява, а култарът забавя преминаването на етапите на образуване на корени при такива условия. Многобройни експерименти върху зелени резници убедително показват, че вкореняването на резници е силно инхибирано, ако те са поставени изцяло на тъмно (необходимо е само за основата на резника). Като се има предвид тази реакция на резниците към липсата на светлина, тествахме различни методи за засенчване на основата на издънката in vitro. Подложките 62-396 се засаждат в капсула от фолио, пълна с хранителна среда, или в хранителната среда се въвежда активен въглен. Най-висок процент на вкореняване (86%) е отбелязан във варианта, използващ капсулата. Въвеждането на активен въглен в средата намалява вкореняването с 35%. Известно е, че 1 mg активен въглен може да абсорбира 100 µg 6BAP и NAA. Активният въглен съдържа феноламиди, които могат да повлияят неблагоприятно на вкореняването. Активният въглен абсорбира етилен, което има двусмислен ефект върху процесите на ризогенеза. Използването на вкоренената капсула стимулира интензивния растеж на кореновата система по дължина, развитието на корени от втори ред. Въпреки това, използването на капсулата не е технологично напреднало. Разработихме композиционна среда, която значително подобрява вкореняването на ябълковото дърво поради ефекта на етиолиране. Отличителна чертатакава среда от стандарта е поставянето върху стандартна среда за вкореняване или размножаване на слой среда (2-3 mm), състоящ се от вода, агар и активен въглен (2-5%). Композитната среда допринася за вкореняването на леторастите след 4-тия пасаж, 2-кратно увеличение на общия брой корени, корени от втори ред и стимулира ризогенезата на среда, съдържаща 6BAP. След 1,5 месеца дължината на вкоренените леторасти върху среда, съдържаща 6 mg/l 6BAP. се увеличи 2 пъти. Увеличението на леторастите в контролата е 27% от опитния вариант. Светлината (стандартна среда) инхибира растежа на корените по дължина и развитието на корени от втори ред. На композитната среда корените се развиват между основната среда и потъмнения слой. До края на пасажа по корените се развиват коренови косми. Ако стените на съда бяха потъмнени с фолио, тогава кореновата система също се развива вътре в средата. Въз основа на получените данни вкореняването на дървесните растения трябва да започне след 4-5-ия пасаж. За по-нататъшно размножаване трябва да се използват издънки, по-дълги от 2,5 см, тъй като те нямат предпоставки за вид на стъкловидното тяло. Издънките с дължина под 1,5 см трябва да се трансплантират в среда с намалено съдържание на 6BAP (0,1 mg/l), а за вкореняване се използват издънки с дължина 1,5-2,5 см.

Жизнеспособността на растенията при нестерилни условия се определя до голяма степен от способността на растенията in vitro и in vivo да растат бързо. При условия in vitro това свойство зависи от културата, регулаторите на растежа и условията на отглеждане. Често на този етап се отбелязва смъртта на върховете на вкоренените растения. В тази връзка изследвахме ефекта на електростатично поле (10–40 kW/m) върху вкореняването на крушови издънки на фона на различни регулатори на растежа. Електростатичното поле променя естеството на ризогенезата и растежа на вкоренените издънки. При най-добрите опитни варианти броят на жизнеспособните леторасти е по-голям с 47,5%, дължината им надвишава дължината на контролните със 17%, броят на корените и дължината им се увеличават.

Размерът на страничните издънки също оказва влияние върху тяхното вкореняване in vitro. С увеличаване на дължината на страничните издънки броят на корените, тяхната дължина, височина на растението се увеличава и броят на листата намалява. Скоростта на растеж на надземната система е по-висока при издънки с дължина 0,5 см. Увеличаването на броя на листата при малките издънки очевидно е свързано с остатъчния ефект на 6BAP. Възможно е малкият растеж на леторастите да се обяснява с преобладаването на техния растеж чрез разделяне на етапа на пролиферация на леторастите, което се реализира чрез увеличаване на броя на листата на етапа на вкореняване.

Скоростта на вкореняване на ябълковите издънки също зависи от тяхната дължина. Късите издънки на клонирана подложка 62-396 са способни да се вкореняват, но развитието на надземната и кореновата система е слабо. Ефективна техника за увеличаване на вкореняването на леторастите е да се наранят основата им, особено надлъжните разфасовки на леторастите. С този метод скоростта на вкореняване се е увеличила с 27% и броят на корените на шпоровата форма на ялон се е увеличил с 4 пъти.

Преминаването на основните етапи на микроразмножаване е невъзможно или много трудно без включването на регулатори на растежа в хранителната среда. За да се получи желаната посока на морфогенеза, понякога е необходимо да се използват във високи концентрации, което може да предизвика странични нежелани реакции (образуване на калус, стъкловидност, преждевременна смърт на отделни органи). В същото време е известно, че действието на растежните регулатори се определя от способността им да проникват в клетката. Повърхностно активните вещества (повърхностно активните вещества) могат да отслабят някои бариери пред проникването на веществата в клетката. Ефектът на tween-40 зависи от неговата концентрация, положителен ефект е отбелязан при варианти с tween-40 (0,5-1 mg/l). При тази концентрация началото и интензивността на образуване на корени се осъществява при по-ниско съдържание на индуктори на коренообразуване в средата (0,1 mg/l IBA). По-високите концентрации на tween-40 намаляват способността на ягодовите издънки за ризогенеза. По-активен в този процес беше натриевият хумат в концентрация 0,5 mg/l.

Получаването на цяло растение in vitro и естеството на неговото развитие зависи от солта и хормоналния състав на средата преди вкореняването.

Процесът на коренообразуване на страничните издънки на розите протича по-добре, ако предишният пасаж за размножаване се извършва на среда, в която съотношението NH4:N03 е 1: 2. При това съотношение броят на корените и тяхната дължина се увеличават значително. Височината на надземната система не зависи от съотношението на амоняк и нитратен азот. Вкореняването на страничните издънки на крушата зависи от съдържанието на 6BAP в хранителната среда за размножаване (Таблица 7).

Въпреки липсата на връзка между концентрацията на 6BAP и последващото вкореняване на леторастите, има тенденция за увеличаването му с повишаване на концентрацията на 6BAP. Намалява броят на растенията с мъртви връхчета и се потиска способността на корените от първи ред да се разклоняват. Тази реакция на крушата към 6BAP е в съответствие с нейните физиологични свойства като цитокинин. Изследването на качествения състав на пъпките в процеса на преминаване на ягоди показа, че при използване на високи концентрации от 6BAP (1 mg/l) в хранителната среда във всички сортове (Fragineta, Haveland, Zarya, Ko-kinskaya ранна, Redgontlit , разсад 139-13-11) започвайки от 4-5-ия пасаж, броят на пъпките, неспособни да развият пълноценни растения, се увеличава. Очевидно това се дължи на продължително излагане на висока концентрация на 6BAP.

Агарът е най-често използваният желиращ материал в тъканната култура. Това е най-скъпият компонент на околната среда. В тази връзка се търсят заместители на агар, които имат желиращи свойства. В нашите експерименти проведохме тест с гелрит*. Използването на гелрит (0,5-2,5 g/l) при вкореняване на подложка 62-396 стимулира развитието на стъкловидност. Броят на стъкловидните растения се намалява, когато се използва гелрит заедно с агар (2,5 g/l). Такава реакция на растителните тъкани може да е свързана със способността им да абсорбира двувалентни катиони.

констатации

1. Вкореняване на ягодови филизи е възможно при първия, робиния и вайгела при второ преминаване, ябълка и круша след 5-10 пасаж, в зависимост от хормоналния и солевия състав на средата. Намаляване на околната среда на M.S. с 1/2 от макроелементите или с 1/2 -1/3 от общия азот помага за увеличаване на вкореняването на леторастите на ягодите и ябълковите дървета.

2. Естеството на вкореняване на леторастите in vitro зависи от използваните индуктори на коренообразуване, техните концентрации и комбинации. С въвеждането на натриев хумат, крезацин, мивал, култара в хранителната среда, вкореняването значително се увеличава и развитието на калуса намалява. Културата допринася за развитието на кореновата система директно от меристематичния връх с размер 250-300 микрона, докато корените са оцветени в зелено. Използването на повърхностно активни вещества (CEP, tween-40) повишава активността на IMC с 2 пъти и намалява активността на културното растение с 6 пъти и прави възможно извършването на етапа на вкореняване при по-ниски концентрации на ауксини. Комбинираната употреба на IMC и AgNO3 ускорява началото на образуването на корени в ягодите.

3. Вкореняването на ябълковите леторасти зависи от метода и продължителността на етиолацията, температурния режим и регулаторите на растежа. Етиолирането на пролифериращи култури при ниски температури допълнително увеличава вкореняването на леторастите в средата с IBA и намалява в средата с култар и мивал. Композитната среда допринесе за вкореняването на ябълковите издънки след 4-ти пасаж, увеличаване на броя на корените от втори ред, листната площ и стимулиране развитието на надземната и кореновата система върху средата с 6 БАП (6 mg/ л).

4. Структурната среда, състояща се от перлит и агар в съотношение 0,5-1:1 по обем, допринася за получаване на добре развита коренова система на ягоди, позволява да се намали концентрацията на агар с 3 пъти.

5. Видът и концентрацията на въглехидратите в средата оказват влияние върху естеството на ризогенезата на растенията. Най-приемливи трябва да бъдат признати като захароза и глюкоза.

Библиографски списък

1. Алабина O.N. Обосновка на методите за приготвяне на майчини от горски плодове

храсти за вегетативно размножаване: / O.N. Аладина / Дис. док. с.-х. Науки: 00.01.07. М., 2004.

2. Катаева Н.В. Особености на микроразмножаване на трудно вкоренявани

усти на ябълково дърво / Н. В. Катаева // Селскостопанска биология. М., 1986. Бр. 4.

3. Кефели В.И. Онтогенеза. М., 1970 г.

4. Орлов П.Н. Ролята на перивискуларните влакна при образуването на допълнителни корени в зелените резници на градински растения // Плодоводство ТША, 1985. Бр. 6. С. 102-115.

5. Abbott A.J. Култура на тъкани на Mallus in vitro размножаване на ябълкови растения от изолирани върхове на леторастите// Sci. Хортикулт, 1976. No 4. С. 183-185.

6. Amitrani A. et al. Влияние на момента на приложение на IBA и тъмнината върху in vitro вкореняване на M27 // Agr. Мед. Т., 1989. No 119. С. 417-423.

7. Bartoline G. Ефектите на регулаторите на синтеза на етилен върху вкореняването на резници Olea European L. // Acta Horticult, 1986. V. 8.

8. Brian C.H., Hicks G. Micropropagation of the Cold-hardy apple rootstock KSC-3 // Can. J. of Plant Sci., 1989. V. 69. No. 2. P. 555-564.

9. Карденас гол. Алисия и др. Потенциална osmotica del medio de cultivocon различни компоненти на парала размножаване in vitro // Rev. фито тийнейджър. Мех., 2002. Т. 25. No 2. С. 213-217.

10. Chu C.J. Ефекти от техниките за микроразмножаване върху израстването и развитието на миниатюрни рози // Hort. наук., 1990. Т. 25. No 3.

11. Денис П., Стмарт и др. In vitro пролиферация на издънки на Pyrus calleriana от вегетативни пъпки // Hort. наук., 1989. Т. 24. № 2. С. 298-299.

12. Doolan D.W., Hennerby M.J., Moorgan J.V. Култура на микроразмножаване

ягодови растения в техниката на хранителен филм // Acta. Horticult, 1983. No133.

13. Druart P. In vitro насърчаване на образуването на корени чрез прилагане на издънки чрез ефект на тъмнина върху ендогенни феноли и пероксидази // Z. Pflanrenphysiol, 1982. № 1085. P. 429-436.

14. Eliasson I., Bollmark Marie. Етиленът като възможен медиатор на индуцирано от светлина инхибиране или растеж на корените // Physiol Plant, 1988. V. 72. No. 2. P. 605-609.

15. James D. J. et al. Контролът на ризогенезата in vitro в трудно вкореняващи се ябълкови подложки // Растителна тъканна култура, 1982. С. 187-198.

16. Женев Р.Л. Образуване на корени в резници от английски бръшлян, третирани с Paclobutra-zol // Hort. наук.. 1980. Т. 25. бр.6.

17. Kopcewier I. Влиянието на червената светлина върху нивото на ауксина в колеоптилите на етиолирани семена - светлини в два сорта овес // Взаимодействие. Plant Symp. Occas, 1985. V. 175. P. 47-48.

18. Николай I.R. Използването на флуоресцентна микроскопия за наблюдение на развитието на корена в микроразмножен експлант // J. of Hort. наук., 1986. Т. 61. No 4. С. 417-421.

19. Pliego-Alfare F.J. Разработване на биотест за вкореняване in vitro с помощта на млади стъблени резници на Persea americane Mill // Hort Sci., 1988. V. 63. No. 2. С. 295-301.

20. Рафаел Плюс. Индуцирано от IAA случайно образуване на корен при рязане на зелена дървесина на populas tremula и образуване на 2-индолин-3ацетиапаратинова киселина, нов метаболит на екзогенно приложена IAA // Physiol. Завод, 1989. Т. 75. С. 86-89.

21. Reiner I. Контрол на морфогенезата в култура на растителна тъкан чрез хормони и азотни съединения // Вещества за растеж на растенията, 1970. P. 686-694.

22. Рипли К.П. et al. Микроразмножаване на Euphorbia lathyris // Растение. Култура на клетъчна тъкан и органи, 1986. Т. 5. № 3. 213-218.

23. Rugini E. et al. In vitro контрол на виртификацията на леторастите в бадеми и разработване на техника за елиминиране на некроза на върха и фото-окисляване на основата на издънката в шам фъстък // Hort. наук., 1986. Т. 21. No 3.

24. Скот Е. Захароза и азотна регулация на случайно иницииране на корени от култивиран връх на розовия издън, Hort. науки, 1984. Т. 14.

25. Smith D.L. Свързана с етилен фазова промяна от ювенилен към зрял фенотип на лилия // Physiol. Plantarum, 1989. Т. 76. С. 466-473.

26. Такаши Харада и др. Stades Морфогенезата на образуването на органи на аспержи в култура in vitro на сегменти с възел, възбуден от разсад на леторастите // J. Fac. Agr. Hokkaido Univ. 1983. V. 61. No. 3. P. 295-306.

Рецензент – доктор на селскостопанските науки. н. A.V. Исачкин

В статията са представени резултати от дългосрочно изследване на влиянието на различни растежни регулатори, въглехидрати, продължителност на преминаване, качество на агара, структура на средата, физиологичен състав на хранителния разтвор върху растежа на корените. Обсъдени са както етапите, така и продължителността на ризогенезата. Много внимание се отделя на проблема с етиолацията, физическите фактори, както хормоналния, така и физиологичния състав на хранителната среда. В статията са дадени както верни, така и важни данни за влиянието на състава на светлината и средата върху ризогенезата и жизнеспособността на растенията при нестерилни условия.

Ключови думи: in vitro, регулатори на растежа, хранителна среда, етиолация, въглехидрати, ягоди, ябълково дърво, круша, люляк, роза, китайска актинидия, ясен.

Деменко Василий Иванович - доктор на селскостопанските науки Н., РГАУ - МШЛ на името на К.Л. Тимирязев. тел. 976-21-98.

Лебедев Вадим Григориевич - д.м.н. н.с., Институт по биоорганична химия на името на акад. М.М. Шемякина и ЮА. Овчинников RAS.

Шестибратов Константин Александрович - д.м.н. н.с., Институт по биоорганична химия на името на акад. М.М. Шемякин и Ю.А. Овчинников RAS.

19713 0

Всяка растителна тъкан е общност от клетки и ако е изолирана (изолирана) от целия организъм, тогава тя е лишена от своето регулаторно влияние и хранене. Следователно, един от принципите на метода на тъканна (клетъчна) култура е да се възпроизвеждат in vitro условия, близки или идентични с тези, при които клетките са на майчиното растение, за да се осигури тяхното правилно хранене и развитие.

След това, при стриктно спазване на тези условия, клетки и растения, идентични с оригиналния генотип, се размножават (регенерират) в тъканната култура. Това е една от употребите. Ако обаче такива условия са постигнати и не се възпроизведат напълно, тогава клетката се намира в относително различни физикохимични условия, което води до временна и качествена промяна в изпълнението на нейната генетична информация.

Чрез изместване на времевата реализация на генетичната информация в експеримента (с помощта на хормонални влияния) може да се наблюдава нейната модификация и под въздействието на различни екстремни трансформиращи фактори тя може да се промени в правилната посока. Клетка в условия на култура in vitro проявява цитогенетична нестабилност, в резултат на което възникват клетки с генетична хетерогенност, появяват се мутанти с променена морфогенеза, които могат да бъдат изходен материал за селекция.

Съставът на хранителните среди и ролята на отделните им компоненти

Хранителната среда за култивиране на изолирани клетки и тъкани трябва да включва всички необходими за растенията неорганични елементи: макроелементи в милимоларни концентрации (азот, фосфор, калий, калций, магнезий, сяра), микроелементи в микромоларни концентрации (желязо, бор, манган, цинк, мед, молибден и др.), както и органични елементи: витамини, въглехидрати, аминокиселини и други (например казеинов хидролизат, мезоинозитол и др.).

В зависимост от консистенцията има разделение на течни и твърди хранителни среди.

За приготвянето на твърди хранителни среди се използва агар-агар (0,7-1%), който е полизахарид, получен от морски водорасли. Обичайната му концентрация е 8-10 g на литър среда. Агарът осигурява дифузията на хранителните вещества от средата в култивираните тъкани. Вместо агар могат да се използват биогелове.

Трябва да се има предвид, че растителните клетки и отделните компоненти на средата (витамини, фитохормони, агар) са чувствителни към определени концентрации на водородни йони. Например агарът в кисела среда губи способността си да образува гел. В зависимост от обектите на култивиране, рН на средата може да варира от 5,2 до 6,6.

неорганични елементи. Растенията се нуждаят предимно от въглерод, кислород и водород, за да растат. Ако във въздуха присъстват кислород и водород, тогава органичните съединения са източник на въглерод за култура на изолирани тъкани. Но освен това, за да се осигури пълноценен метаболизъм и неговото регулиране в изолирана култура, са необходими редица макро- и микроелементи от неорганичен произход.

Макроелементите присъстват в средата в концентрации около 10 М. Най-значимите от тях са азот, фосфор, натрий, калий, магнезий, калций и сяра.

Микроелементите в средата са в концентрации 10-6 М. Наличието им е задължително при култивиране на тъкан в течна среда. Според някои доклади липсата на микроелементи намалява скоростта на растеж с 40% при първото преминаване и води до смъртта на културата по време на следващите две трансплантации. На агарова среда растенията не реагират толкова рязко на липсата на микроелементи, тъй като агарът съдържа много микро- и някои макроелементи.

Най-важните микроелементи са желязото и медта, защото участват в регулаторните процеси и редокс трансформациите и са част от важни коензими. Следват манган, цинк, молибден, кобалт и бор.

Органични компоненти на медиите. Според многобройни данни уреята е добър източник на азот, особено за тъканите на слънчоглед, тютюн, ерусалимски артишок и др.

Като допълнителен източник на азот към средата се добавят аминокиселини (α-аланин, глутаминова киселина, глицин, аргинин, аспарагинова киселина) или казеинов хидролизат, източник на аминокиселини.

В културата на изолирани растителни тъкани действието на аминокиселините варира значително за различните тъкани и различни физиологични състояния на експлантите, въведени в културата. Аланин, аргинин, глутаминова и аспарагинова киселини, гликокол, аспарагин, пролин са способни напълно да заменят нитратите като източник на азот.

Формите на аминокиселини също влияят на растежа по различни начини: D-формите са токсични, L-формите са подходящи. Аминокиселините, въведени в хранителната среда в допълнение към нитратите, могат да имат стимулиращ, инхибиращ и формиращ ефект върху растежа на тъканната култура. Зависи както от самата аминокиселина, така и от съдържанието й в средата.

Много често изследователите заменят сместа от аминокиселини с казеинов хидролизат. Последният е в състояние да увеличи съдържанието на никотин в тютюневите култури и да потисне липидната биосинтеза в много калусни и суспензионни култури.

Въглехидратите са необходим компонент на хранителните среди за култивирането на изолирани растителни клетки и тъкани, тъй като в повечето случаи последните не са способни на автотрофно хранене.

Тъканните култури, дори когато са зелени на светлина, не са автотрофни по отношение на въглехидратното хранене. Когато се изолират парчета тъкани, носещи хлорофил, и се поставят върху хранителна среда, те като правило губят хлорофил.

Когато се отглеждат на светлина, някои тъкани остават лишени от хлорофил (жлъчен тумор на партеноцис, тъкани на сърцевината на паренхима на тютюна и др.). Други тъкани стават зелени на светлина, но не са в състояние да се осигурят напълно с въглехидрати чрез фотосинтеза и трябва да се отглеждат върху хранителни среди, съдържащи захар.

Когато парче тъкан, изолирано от растение, се постави върху хранителна среда без захар, съдържанието му в тъканта започва да намалява.

Изхвърлянето на захари зависи от сезонните промени в самата тъкан (взетите през пролетта тъкани губят повече захари) и от съдържанието на ауксини в средата. С образуването на калус старата тъкан бързо губи захари, а в новообразуваните броят им се увеличава. Когато тъкан се постави върху хранителна среда, снабдена със захар, тъканите абсорбират и трансформират захарите. Количеството на усвоената захар и особено нейното превръщане в други форми зависи както от източника на захари в средата, така и от вида на тъканта.

Най-добрият източник на въглеродно хранене за повечето тъкани е захарозата, нейната често използвана концентрация в хранителната среда е 2-5%. Най-често захарозата се използва като въглехидрати в концентрация 3%. В допълнение към захарозата като източник на въглеродно хранене могат да се използват глюкоза, фруктоза, галактоза и др. След захарозата, най-използваният източник на въглеродно хранене за култивиране на растителни тъкани е глюкозата. От 33 изследвани култури (тревисти и дървесни) 85% имат отличен и добър растеж на среда с глюкоза.

Фруктозата заема третото място по ефективност на използването на растителни тъканни култури. Успешно се използва за растежа си от 2/3 от културите фруктоза. Галактозата се различава значително от глюкозата и фруктозата по ефекта си върху растежа на изолирани растителни тъкани. Повече от половината от изследваните култури не използват почти никаква галактоза за растеж. Въпреки това има данни, показващи положителната роля на галактозата за култивирането на растителни тъкани и органи.

За разлика от изолираните корени, които могат да растат само на среда със захароза, други тъкани с активни хидролитични ензими могат да използват голямо разнообразие от захари и полизахариди за хранене. Способността на тъканта да абсорбира определени захари зависи от нейния произход. Прехвърлянето на тъкан от среда по-бедна на захар към по-богата среда обикновено не предизвиква нежелани ефекти, обратният трансфер води до тъканна некроза.

Основният ефект на захарозата е да повиши нивото на образуване на метаболити, използването на първоначално повишени концентрации на захароза обикновено води до увеличаване на добива на вторични метаболити в културите. Ефектът от първоначално високи концентрации на захароза вероятно се състои в повишаване на осмотичния потенциал на средата.
Трябва да се отбележи влиянието на условията на стерилизация върху действието на захарите. При автоклавиране захарозата дава следи от глюкоза и фруктоза, а в среда със захароза, която не е претърпяла специално пречистване, се наблюдава образуването на вещества, които стимулират растежа на тъканите.

Отглеждането на тъкани с хлорофил и без хлорофил на светлина или на тъмно променя както съдържанието на разтворими захари в тъканта, така и съотношението на различните им групи. Разликите в спектралния състав на светлината влияят и на въглехидратния метаболизъм на тъканите.

Витамините принадлежат към активните вещества, които играят съществена роля в тъканната култура. Известно е, че в процеса на растеж растенията синтезират необходимото количество витамини. Въпреки това проучванията показват, че когато към хранителната среда се добавят витамини, растежът на тъканите се подобрява. Повечето от витамините са част от ензимите, които катализират много метаболитно важни реакции. Витамините се делят на водоразтворими и мастноразтворими.

Съставът на средата най-често включва водоразтворими витамини: тиамин, рибофлавин, биотин, пантотенова киселина, пиридоксин, аскорбинова киселина. С добавянето на пълна смес от витамини, стимулиращият ефект може да се определи чрез синергия между отделните витамини. Според наблюденията на Хендерсън, сместа от витамини е най-активна след слаб растеж на тъканите в предишния пасаж.

Ефектът на витамините върху растежа на тъканната култура зависи от способността на тъканта да ги синтезира в оптимални или неоптимални количества и от състава на други компоненти на хранителната смес, с които витамините могат да взаимодействат синергично или антагонистично. Интересно е, че клетъчната суспензия, получена чрез поставяне на тъканта в течна среда по време на преминаване, е много по-чувствителна към дефицит на витамин от самата тъкан. Изключване от околната среда на холин и аскорбинова киселинаводи до увеличаване на единичните суспендирани клетки. Трябва да се отбележи, че във всеки конкретен случай мястото на отделния витамин в сложната метаболитна верига е различно.

Растителните и животинските клетки са по-чувствителни от микроорганизмите към присъствието на чужди съставки и следователно изискват химически чисти компоненти на средата.

В същото време някои хранителни среди съдържат естествени биологични добавки: течен ендосперм от кокос (кокосово мляко), кестен, картофен бульон и др. Те са доставчици на по-балансирани хранителни компоненти в сравнение с изкуствените среди.

За да се предотврати възможно бактериално и гъбично замърсяване, понякога към средата се добавят антибиотици като полиени (амфотерицин В, нистатин), карбеницилин, цефалоспорин и неговите производни, левомицетин, аминогликозиди (гентамицин сулфат, канамицин моносулфат), рифамгашин и др. Повечето антибиотици са нестабилни при нагряване, така че техните разтвори се стерилизират чрез филтриране през мембрани.

Наличието на макро- и микроелементи в състава на хранителната среда се определя от нуждите на обектите на отглеждане. Широко използваните в момента среди на Хамбург В5 и Мурашиге и Скуг (MS) (Таблица 4.1, Таблица 4.2) съдържат значително по-големи количества калий, фосфор и микроелементи в сравнение със средата на Уайт.

Таблица 4.1. Примери за съставите на най-често използваните хранителни среди за култивиране на клетки от растителна тъкан

В момента има голям брой различни формулировки на хранителни среди за култивиране на изолирани тъкани и клетки. Съставът им зависи от задачите на отглеждане, растителни видове и видове експланти. Най-често използваната среда на Мурашиге и Скуг е съставена и предложена за първи път през 1962 г. Освен това днес са широко известни медиите White, Nitsch, B5, N6 и други (Таблица 4.1), които се различават по набора от отделни компоненти и тяхното съотношение . Има и търговски препарати на хранителни среди, произведени от чуждестранни и руски компании.

Таблица 4.2. Съставът на средата Мурашиге-Скуг

MS е най-универсалната среда, подходяща за образуване и растеж на калус, индуциране на морфогенеза в повечето двусемеделни растения. Wednesday Gamborg и Eveleg са приложими за бобови и зърнени култури. Средата на Уайт осигурява вкореняване на леторастите и нормален растеж на стъблото след регенерация. Средата на Nitsch се препоръчва за индуциране на андрогенеза в култура на прашници.

НА. Войнов, Т.Г. Волова

Клетките стареят не само in vivo, но и in vitro. Освен това при условия in vitro особено ясно се проявява ролята на хипероксията, естествен и очевидно единствен фактор за тяхното стареене при тези условия.
1.8.1. Както е известно, култивирането на клетки извън тялото се извършва в специални съдове (колби) при атмосферно налягане и следователно при pO2, което е много по-високо от стойностите, които обикновено се установяват в тялото. Обикновено в инкубационната течност рО2 е близо до рО2 на въздуха. Молекулите O2 свободно дифундират през тънък слой от хранителната среда в колбата към клетките и вътре в тях се установява високо pO2, което е невъзможно in vivo или във всеки случай надвишава допустимите стойности.
От гледна точка на кислородно-пероксидната концепция за стареене, условията in vitro изглеждат повече от подходящи за изследване на процеса на стареене на клетките, тъй като при тези условия той протича по-интензивно, с ускорени темпове и, което е много важно , в „чист” вид, т.е. при пълно отсъствие на каквото и да е влияние на телесните системи, което се случва по време на стареене in vivo. Това обстоятелство незабавно поставя много теории за стареенето в категорията на вторични или чисто спекулативни, тъй като свързаните с възрастта промени настъпват или могат да настъпят дори без прилагането на постулираните в тях разпоредби. Фактът, че придаваме такова значение на феномена клетъчно стареене in vitro, се дължи на факта, че именно при тези „прости“ условия ще бъде възможно бързо и с по-малко трудности да се разберат физикохимичните основи на стареенето и същността на биологията на този процес като цяло.
Понастоящем обаче няма консенсус относно общостта на причините и механизмите на стареене на клетъчни култури и стареене на клетките в многоклетъчен организъм, както се вижда от противоположни гледни точки в литературата (Капитанов, 1986). Канунго (Kanungo, 1982), например, въпреки че вярва, че причината за стареенето на организма е стареенето на неговите клетки, в същото време той вярва: „ин витро условията не отговарят на физиологичните и свойствата на клетките може да бъде променен. Докато проучванията in vitro предоставят полезна информация за самата клетка, те са с ограничена стойност, когато става въпрос за стареене като цяло. Можем само частично да се съгласим с горното твърдение. Всъщност стареенето на клетките in vitro не може да отразява целия сложен спектър от свързани с възрастта промени, настъпващи в целия организъм на всички нива и освен това до голяма степен определяни от системата от различни връзки в него, включително и обратни. По отношение на условията in vitro, редица принципи на стареене, които се проявяват на ниво организм, губят своето значение (вж. Раздел 1.1.2), но някои от тях продължават да действат в клетъчни култури. Такива по-специално са мултифокалният характер на процеса на стареене, т.е. развитието на увреждане в различни части на клетката или в нейните различни молекулярни цикли и хетерохронността на стареенето между клетки от същия култивиран тип. Освен това при тези условия принципите на необратимост, неконтролируемост и непрекъснатост на стареенето на клетките очевидно трябва да се проявят по-ясно.
Горните недостатъци в изследването на клетъчното стареене извън тялото изглежда не са фундаментални, ако се има предвид, че една от основните задачи на геронтологията е да установи основния първичен фактор на околната среда, който определя стареенето на всички живи организми. Ние вярваме, че хипероксията в земната атмосфера е такъв фактор; следователно животът на клетките при условия in vitro може да се счита за удобен експериментален модел за изследване на ефекта на този конкретен физически фактор върху стареенето на клетките. Обичайните 18-21% съдържание на O2 във въздуха и съответно високите нива на дисбаланс Δ (PO - AO) и пероксигеназните процеси имат потискащ ефект върху субклетъчните елементи, върху нормалните физиологични и метаболитни процеси. В резултат на това последните постепенно избледняват и повечето клетки умират поради окислителна цитолиза или чрез кислородно-пероксидния механизъм на апоптоза (вж. Раздел 7.1).
Има повече от достатъчно факти, показващи водещата роля на излишъка на pO2, ROS и LPO за намаляване на оцеляването на клетките при in vitro условия и защитния ефект на различни антиоксидантни фактори (Branton et al., 1998; Drukarch et al., 1998; Heppner и др., 1998). Напоследък L-карнозинът също беше включен сред последните. Добавянето на физиологични концентрации от него към стандартните среди увеличава живота на човешките фибробласти in vitro и забавя процесите на физиологично стареене в тях. Клетките, пасирани върху обикновена среда за дълго време след прехвърляне в среда, съдържаща карнозин, показват подмладяващ ефект. Оптичният изомер на D-карнозин не притежава посочените свойства (Hallyday and McFarland, 2000). В същото време, в хода на продължително култивиране, определен процент клетки не само не се разграждат, но се адаптират към токсични окислителни състояния, „постига“, че вътреклетъчният параметър Δ (PO - AO) не се повишава до високи стойности на ΔA2 или ΔC, но може да спре при малко по-ниско ниво на ΔK, което е необходимо за злокачествената им трансформация. Случаите на „спонтанно” злокачествено заболяване на клетките в културата и възможният му механизъм са разгледани от нас отделно в Глава 4.
1.8.2. Горните съображения могат да се считат за част от нашите теоретични положения за причините и последствията от клетъчното стареене in vitro. За да се потвърдят и развият тези положения, естествено е да се позоваваме на някои вече известни факти, чието съдържание и смисъл лесно могат да бъдат „вписани“ в кислородно-пероксидната концепция за стареенето на клетките. Нека започнем с факта, че гореописаните обичайни условия за култивиране на клетки, които са токсични за тях, могат да бъдат смекчени чрез изкуствено намаляване на концентрацията на O2 в газовата среда. В този случай инхибиторният ефект на хипероксията и скоростта на стареене на клетките трябва да намалеят. Трябва също да се има предвид, че такава добре позната биологична константа като границата на Хейфлик всъщност се оказа променлива стойност в зависимост от съдържанието на O2 в газовата среда и тази граница намалява при условия на оксидативен стрес и на напротив, нараства с намаляване на рО2 (Chen et al., 1995).
Действително, наличието на култура от фибробласти в атмосфера с ниско съдържание на O2 (10%) удължава живота им с 20-30%. Същото се случва с човешки и миши белодробни клетки (Packer and Walton, 1977). Периодът на пролиферативна жизнеспособност на диплоидни човешки IMR90 фибробласти с различни първоначални нива на удвояване на популацията се увеличава с намаляване на съдържанието на O2 в средата до 1,6 или 12%. Този период при 1% O2 се увеличава с 22%, а връщането на културите от средата с 1% O2 в средата с 20% O2 бързо развива тяхното стареене. В култура от диплоидни фибробласти от пациент със синдром на Вернер (ранно стареене), продължителността на репликативната жизнеспособност също се увеличава с намаляване на pO2 (Saito et al., 1995). Забавянето на стареенето на хондроцитите на култивирани пилешки ембриони е показано при 8% съдържание на O2 в атмосферата в сравнение с контролата (18%), а експерименталните клетки запазват признаците на „млади” за по-дълго и имат по-висока скорост на пролиферация (Nevo et. др., 1988). Под въздействието на различни антиоксиданти скоростта на пролиферация на клетъчните култури също се увеличава и тяхното стареене се забавя (Packer and Walton, 1977; Obukhova, 1986), което потвърждава казаното по-горе: явно прекомерното действие на оксидантите потиска клетъчното пролиферация и предизвиква тяхното ускорено стареене.
В експерименти с клетъчни култури също е сравнително лесно да се провери действието на O2-зависимия механизъм за регулиране на количеството на дихателните ензими (Murphy et al., 1984; Suzuki et al., 1998) и митохондриите (Ozernyuk, 1978 ). Според този механизъм, при плавно и бавно повишаване на нивото на хипероксия, съдържанието на такива ензими и броят на митохондриите трябва постепенно да се увеличават, докато по време на хипоксия, напротив, те трябва да намаляват. Всъщност, когато култивираните фибробласти се отглеждат в среда с ниско съдържание на O2, концентрацията на цитохромите е значително намалена (Pius, 1970). Тук, разбира се, се включва обективният процес на адаптация на дихателната система към вътреклетъчното ниво на pO2. Въпреки това, при това явление скоростта на адаптация е от не по-малко значение, от което ще зависи и интензивността на стареене на култивираните клетки. Изглежда очевидно, че в процеса на биологичната еволюция многоклетъчният организъм също постепенно се адаптира към постепенното увеличаване на рО2 в земната атмосфера. В същото време "митохондриалният" адаптационен механизъм може да се счита за най-ефективния вътре в клетките: броят на ензимите на дихателната верига и самите митохондрии варират от самоорганизираща се система, така че да гарантира целостта и относително нормалното функциониране на клетките с промени във вътреклетъчния pO2 в определени еволюционно одобрени граници.
Съвсем различна ситуация се развива, когато клетките се прехвърлят бързо от жив организъм в условия in vitro. Рязкото им преминаване в състояние на хипероксия е равносилно на нанасяне върху тях на значителен спазматичен смущаващ ефект, за който, най-общо казано, те не са подготвени. Как първичната клетъчна култура реагира на такова нарушение? Очевидно през определен начален период културалната среда е „стресова“ за клетките, а състоянието на самите клетки през този период е шок. След това се отделя известно време на подготовка и провеждане на адаптивни „мерки” с антиоксидантен характер, които са възможни при тези екстремни условия. Вероятно благодарение на последното в началото е възможно не само да се избегне окислителното разграждане, но и да се създадат условия за стимулиране на пролиферативния процес, като се намали първоначално високият, ясно „цитотоксичен“ вътреклетъчен дисбаланс на ΔC (PO – AO) до нивото, необходимо за окислителна митогенеза. Но дори този етап от живота на първичната култура не може да не бъде ограничен от хипероксичната среда, която непрекъснато я потиска. В тази ситуация самият адаптивен механизъм започва да се инактивира и съответно натрупването на антиоксидантната система намалява и впоследствие последната регресира. При високо ниво на LPO преди всичко се увреждат митохондриите (вижте раздел 1.3), чийто брой ще продължи да нараства като адаптивен акт в случай на постепенно увеличаване на pO2 в газообразна среда.
Неспособността на адаптивните механизми на клетката бързо и напълно да неутрализират внезапната хипероксия, от една страна, и високата уязвимост на митохондриалната връзка към пероксидативен стрес, от друга страна, обуславят необратимия процес на клетъчна дегенерация след настъпване на „критично ниво“ на щети в тях. Тук е важно да се отбележи още веднъж: деструктивните промени в митохондриите като основни консуматори на O2 и в този смисъл като основна стъпка на антикислородна защита в антиоксидантната система на клетката не оставят надежда за оцеляване на повечето клетки под тежки условия in vitro, тъй като в този случай се нарушава самата адаптация.-тивен механизъм за намаляване на вътреклетъчните нива на pO2 и LPO. Тези съображения са напълно съвместими с основната роля на митохондриалните промени в инициирането на механизма на стареене, постулирана обаче във връзка с фибробласти, култивирани in vitro (Kanungo, 1980).
Пероксидативният стрес и токсичният ефект при условия in vitro могат да бъдат допълнително засилени, ако LPO катализатори, като Fe2+ или Cu2+ йони, се въвеждат в културалната среда. Действително, добавянето на меден сулфат в концентрация от 60 mg/l към култивационната среда доведе до значително намаляване на средната продължителност на живот на коловратите с 9%, както и до значително по-забележимо увеличение на количеството MDA, отколкото в контролът. Авторите на този експеримент (Enesco et al., 1989) логично смятат, че намаляването на продължителността на живота се дължи на ускоряването на процесите на генериране на свободни радикали от медните йони. Посочената концентрация на меден сулфат се оказва оптимална, тъй като по-високите концентрации (90 и 180 mg/l) са твърде токсични за коловратките, а по-ниската (30 mg/l) е неефективна.
Така необратимото ускорено стареене и окислителното разграждане на клетките по време на рязка промяна на местообитанието от in vivo към in vitro са резултат от недостатъчната им готовност да приемат толкова рязко увеличаване на експозицията на кислород без сериозни негативни последици. Ако такъв рязък преход към нови условия бъде заменен с „мек“, например, многоетапен и удължен във времето, тогава може да се очаква, че способността, присъща на клетките да се адаптират към постепенно нарастваща хипероксия, в този случай е напълно реализирана. Още повече, че по принцип по този начин е възможно да се постигне адаптация на клетките не само към обичайното ниво на O2 в атмосферата от 18-21%, но и към изкуствено създадена хипероксична среда, която е значително по-висока от нея. В подкрепа на казаното се позоваваме на много убедителните факти, получени от Welk et al. (Valk et al., 1985). В резултат на постепенното адаптиране към нарастващите концентрации на O2, те са получили клетъчна линия от яйчници на китайски хамстер, която е устойчива на високо съдържание на O2 и способна да се размножава дори при 99% O2 в атмосферата. Към такава значителна хипероксия и зависещи от нея процеси се оказаха адаптирани всички етапи на защита - антикислородна, антирадикалова и антипероксидна (за повече подробности за тези резултати вижте глава 4).
1.8.3. Горните съображения за особеностите на промените в прооксидантно-антиоксидантния дисбаланс в култивираните клетки като основен активен фактор за тяхното стареене и трансформация могат условно да бъдат представени графично (виж фиг. 11). Крива 1, която отразява тези промени по време на бързото движение на клетките в средата in vitro, показва три последователни етапа във времето, които изглежда съответстват на адаптивната (латентна) фаза, логаритмичната фаза на растеж и стационарната фаза, позната в литература. В този случай стареенето на клетъчните култури обикновено се свързва с процеси в стационарна фаза, където с течение на времето те претърпяват различни промени, подобни на наблюдаваните в клетките на стареещ организъм (Капитанов, 1986; Хохлов, 1988). По-специално, ензимите се променят по време на клетъчното стареене in vitro и настъпва тяхната анеу- и полиплоидизация (Remacle, 1989). Подобно на клетките in vivo, култивираните клетки натрупват липофусцин гранули със стареенето (Obukhova and Emanuel, 1984), което показва очевидния ход на пероксидните процеси и оксидативните нарушения в структурата на липидите и протеините. Тези и редица други факти, по един или друг начин, могат да бъдат в съответствие с хипотезата за кислородно-пероксидния (свободните радикали) механизъм на стареене. Най-вече този механизъм се подкрепя от данни, че с увеличаване на концентрацията на антиоксиданти животът на клетките in vitro е по-дълъг, а с намаляване е по-кратък, отколкото в контролата. Такива резултати са получени, например, чрез промяна на съдържанието на GSH в човешки фибробласти (Shuji and Matsuo, 1988), каталаза и SOD в култивирани неврони (Drukarch et al., 1998).
Що се отнася до плоските и относително плавно нарастващи криви 2 на фиг. 11, това им естество се обяснява с факта, че всяко малко изкуствено създадено увеличение на прооксидантния компонент на дисбаланса Δ (PO - AO) в клетката е последвано с известно закъснение от съответното адаптивно увеличение на антиоксидантния компонент в нея. Многократното повторение на това действие осигурява адаптацията и оцеляването на клетките с постепенно, стъпаловидно повишаване на нивото на хипероксия.
И в двата случая нека обърнем внимание на вариантите, водещи до т. нар. „спонтанно“ злокачествено заболяване на клетките (вж. Глава 4). Това явление, от наша гледна точка, може да се реализира само в онези клетки, където дисбалансът достига стойности на ΔK, които последователно удовлетворяват неравенството (виж клауза 1.1.2)
ΔP (PO - AO), или по-скоро, като се вземат предвид "апоптотичните" дисбаланси, към съотношението (виж параграф 7.1.1)
ΔA1 (PO - AO) С помощта на такива процедури в крайна сметка се формират трансплантируеми линии от трансформирани и туморни клетки, способни да съществуват дълго време извън тялото. В контекста на проблемите, които разглеждаме, по-важно е да се определи подходът за изследване на връзката между стареенето и канцерогенезата. Едно от тях, а именно изследването на самия процес на появата на туморни клетки по време на стареенето на нормалните клетъчни култури (Witten, 1986), изглежда най-естествено и следователно за предпочитане.

Приближаване. Когато се установи дисбаланс на Δ (PO - AO) в интервала между ΔK и ΔC, клетките могат да бъдат подложени на апоптоза тип A2 (вижте раздел 7.1.1).
Според теломерната теория, репликативното клетъчно стареене, включително in vitro условия, е свързано със скъсяване на теломерите след всяка митоза до определена минимална дължина, което води до загуба на способността на тези клетки да се делят (виж раздели 1.4.3 и 1.4). .4). Анализът на известната литература по този въпрос показва, че този постулат не се потвърждава в някои случаи. Пример за това е изследването на Karman et al. (Carman et al., 1998), проведено върху диплоидни ембрионални клетки на сирийския хамстер (SHE). Тези клетки спряха да пролиферират след 20-30 цикъла на удвояване и загубиха способността си да влязат в S-фазата след серумна стимулация. В същото време, SHE клетките експресират теломераза през целия репликативен жизнен цикъл и средният размертеломерата не намалява. Оказва се, че клетките in vitro понякога могат да остареят по механизми, които не са свързани със загубата на теломери.
Струва ни се, че в този случай условията на хипероксия в култивационната среда правят свои собствени корекции. Ако в състояние на умерено повишено ниво на ROS и пероксидацията често изпълняват положителни функции, активирайки отделни етапи от преминаването на митогенния сигнал, репликация, транскрипция и други процеси (това беше обсъдено в редица предишни параграфи и е споменато в някои последващи), то в случай на силен оксидативен стрес неизбежни и негативни последици. Например, някои макромолекули, включително тези, които участват в митогенезата, могат да бъдат модифицирани, които, независимо от теломеразната активност и дължината на теломерите, трябва да инхибират пролиферацията и/или да индуцират някои други нарушения, до и включително клетъчна смърт.
Както и да е, двете причини за стареене на клетките in vitro - натрупване на грешки при условията на тяхното поддържане в културата и скъсяване на теломерите - остават най-вероятни. Смята се, че и в двата случая протеиновите системи p53 и Rb се активират и когато функцията им е нарушена, настъпва клетъчна трансформация (Sherr and DePinho, 2000). По-общо, виждаме следното: при токсични хипероксични условия на култивиране, нормалните клетки, стареене, най-вероятно претърпяват апоптоза на А1, а туморните клетки - на апоптоза на А2. В случай на неизправности в механизма на апоптоза, първите претърпяват неопластична трансформация, докато вторите се подлагат на окислителна цитолиза (вж. раздел 7.1.1).
Допълнителна причина, допринасяща за интензифицирането на процесите на окислително разграждане в клетките in vitro, може да се счита и топлината, като постоянно действащ фактор. заобикаляща среда. Действително, използвайки високочувствителен метод (описан от авторите на Bruskov et al., 2001), беше показано, че ROS се генерират във водни разтвори под действието на топлина. В резултат на термично активиране на атмосферния O2, разтворен във вода, възниква последователност от реакции
O2 → 1O2 → O → HO2˙ → H2O2 → OH˙.
Образуваните ROS, очевидно, допринасят за термичното увреждане на ДНК и други биологични молекули чрез тяхното "автоксидиране".
И накрая, ние отбелязваме друг начин за интензифициране на процеса на стареене на клетките при условия in vitro с помощта на процедурата на аноксия-реоксигенация, резултатите от която според нас най-ясно отразяват същността на кислородно-пероксидния модел на стареене. Механизмът на стареене в този случай се основава на два фундаментални ефекта: адаптивно намаляване (отслабване) на митохондриалната база по време на аноксия или хипоксия (виж по-горе); значително увеличаване на липидната пероксидация и други процеси на окислително разрушаване по време на последваща реоксигенация поради рязко повишаване на pO2 (спрямо състоянието на аноксия) и невъзможността за бързо използване на излишния O2 от "аноксични" митохондрии. Степента на пероксидативен стрес и следователно скоростта на стареене на клетките ще зависят от продължителността на престоя им в състояние на аноксия: колкото по-дълъг е този период, толкова по-добре митохондриалната база ще може да се адаптира към ниско ниво на pO2 и толкова по-значително ще бъде увреждането на клетките след елиминиране на исхемията.
Следният факт може да послужи като пример за осъществяване на клетъчно стареене по посочения „сценарий”. Хепатоцитите, изолирани от плъхове на различна възраст, се подлагат на 2-часова аноксия и 1-часова реоксигенация. Установено е, че във фазата на реоксигенация хепатоцитите произвеждат голямо количество кислородни радикали, отговорни за увреждането на техните мембрани и други структурни и функционални промени, свързани със стареенето, а старите клетки са по-чувствителни към реперфузионно увреждане (Gasbarrini et al., 1998 ). Подобни факти са разгледани от нас в глава 4 във връзка с обсъждането на механизма на стареене и „спонтанното“ злокачествено заболяване на клетките в културата.

Като ръкопис

ХАПОВА Светлана Александровна

УСЛОВИЯ НА КУЛТИВАНЕ IN VITRO И ПОСЛЕДВАЩА ПРОИЗВОДИТЕЛНОСТ НА ЯГОДОВИТЕ РАСТЕНИЯ

Специалност 06.01.07 - овощарство

Москва 1997г

Работата е извършена във Всеруския селекционен и технологичен институт по градинарство и разсадник.

Научен ръководител - кандидат селскостопански науки V.A.Vysotsky.

Официални опоненти: доктор на селскостопанските науки Ф.Я.Поликарпова; Кандидат на селскостопанските науки Т. А. Никиточкина.

Водещо предприятие - Главна ботаническа градина руска академияНауки им. М. Н. Цицина.

Защитата ще се осъществи... ............ 1992 г

в......... часа на заседание на дисертационния съвет Д

20.02.01 във Всеруския селекционен и технологичен институт по градинарство и разсадник на адрес: 115598, Москва, ул. Zag^b^sh, 4, VTISP. Академичен съвет

Дисертацията може да се намери в библиотеката на Всеруския селекционен и технологичен институт по градинарство и разсадник.

Научен секретар на Специализирания съвет, кандидат селскостопански науки

Л. А. ПРИНЕВА

ОБЩО ОПИСАНИЕ НА РАБОТАТА

Актуалност на темата. У нас ягодите са най-популярната ягодоплодна култура. Тя е оценена за ранни датисъзряване.

Постоянното и голямо търсене от населението на пресни ягоди и преработени продукти се дължи на високите им вкусови качества. Ягодите имат страхотен вкус, деликатна текстура на пулпа и приятен аромат, балансирана комбинация от захари и киселини - това ги прави десертен продукт.

През 80-те години на миналия век площта под ягоди е 24 000 хектара, с тенденция за увеличаване на дела на тази култура до 40% от площта, заета от всички горски плодове. В района на Москва ягодите заемат 45% от площта на промишлените насаждения на горски плодове.

Понастоящем културата на ягоди в Нечерноземния регион, както и в Русия като цяло, изисква сериозно внимание поради рязкото намаляване на плододаващите площи след замръзване на растенията в сурови зими, разпространението на редица опасни гъбични и вирусни заболявания. Полагането на нови насаждения от ягоди е затруднено от липсата на достатъчно количество подобрен посадъчен материал от обещаващи сортове. По-специално, биотехническите методи се използват широко в практиката на овощарството за получаване и ускоряване на възпроизвеждането на здрав посадъчен материал за ягоди.

Преди няколко години бяха направени наблюдения, показващи, че растенията, регенерирани от соматични клетки в тъканна култура, не са хомогенни, но показват значителна генетична вариабилност. Тази променливост се нарича "сомаклонална променливост". Възниква въпросът дали сомаклоналната вариабилност е резултат от прилагането на генетични различия, които вече съществуват в соматичните клетки, или е нарушена от компонентите на хранителната среда.

Чрез промяна на състава на хранителната среда, върху която се отглеждат различни видове растения, е възможно да се промени тяхното физиологично състояние, да се засили и забави техния растеж, фотосинтеза и да се увеличи устойчивостта на неблагоприятни въздействия.

За всеки вид и дори сорт култивирано растениесъставът на хранителната среда трябва да бъде избран индивидуално. Освен това една среда е необходима за осигуряване на активен растеж, друга за размножаване, трета за опазване на растенията и четвърта за ускоряване. Следователно, за всяко растение в селското стопанство, като се вземат предвид целите, е необходимо да се разработи специален състав на хранителната среда, като се спазва определен баланс на неговите компоненти. Този факт показва важността и необходимостта от разширяване изследователска работавърху изследване на условията на влияние на хранителната среда in vitro върху поведението на растенията от ягодови регенерати.

Отглеждането на растения при условия in vitro дава възможност да се контролират много фактори на околната среда: температура, влажност, продължителност и интензивност на дневните часове.

Една от основните насоки за повишаване на производителността и устойчивостта на растениевъдството и градинарството в сегашен етап, е използването на интензивни технологии за отглеждане. В повечето случаи като задължителна техника за борба с плевелите такива технологии включват използването на хербициди от ново поколение, които трябва да бъдат високоефективни и в същото време безвредни за хората и околната среда.

Системата за производство на ягодови растения по метода in vitro става все по-актуална, тъй като стойността на посадъчния материал е неизмеримо по-висока от тази на обикновените растения.

Задачи за пеене и изследване. Целта на това проучване е да се проучи ефекта от условията на култивиране върху способността

ягоди от различни групи (обикновени, ремонтантни, неутрални) за размножаване in vitro и последваща продуктивност на растенията.

За постигане на тази цел бяха решени следните задачи:

1. Да се ​​проучи влиянието на продължителността на осветяване на етапите на микроразмножаване върху биометричните показатели.

2. Определете степента на влияние на различния състав на хранителни среди върху коефициента на размножаване на ягодовите експланти.

3. Определете праговите концентрации на хербицидите, въведени в средата за последваща селекция на сомаклонални варианти и трансформанти на базата на хербицидна резистентност.

4. Да се ​​проучи ефекта от времето на прехвърляне на растенията от епруветки в нестерилни условия върху оцеляването.

5. Извършване на сравнителна оценка на развитието на ягодите, получени по метода

in vitro с растения, отглеждани по конвенционални методи в полето.

Научна новост на резултатите от изследванията. Установено е значително влияние на светлинния период върху броя на леторастите и тяхната дължина, броя на листата, както и върху броя и дължината на корените, развиващи се в експлантите на тествани сортове ягоди in vitro.

Изследвано е влиянието на азотните хранителни елементи върху развитието на ягодовите експланти на етапите на пролиферация по време на размножаване. Експериментално е показана възможността за комбинирано използване на 6-бензил-аминопурин и кинетин за стимулиране на странично разклоняване в ягодовите експланти. "

За първи път в културата на ягодовата тъкан е изследван ефектът на хербицидите върху биометричните показатели и пигментната система на развиващите се експланти.

Определени са най-благоприятните условия за засаждане на епруветкови ягодови растения в почвени субстрати в зимни отопляеми оранжерии.

Практическата стойност на работата. Получените резултати дават възможност за оптимизиране на процеса на клоново микроразмножаване на ягоди, намаляване на разходите за труд и производствените разходи в сравнение с конвенционалната технология.

Използването на оптимални условия за прехвърляне на растения в нестерилни условия дава възможност да се увеличи добивът на адаптирани растения с 20% или повече. Идентифицираните селективни концентрации на хербициди могат да се използват за създаване на устойчиви на хербициди форми и получаване на трансгенни растения.

Апробация на работата. Основните положения на дисертационния труд бяха докладвани на Всеруската среща "Млади учени за градинарството в Русия" (Москва, 1995 г.); на IV Международна конференция„Проблеми на дендрологията, цветарството, овощарството, лозарството и винарството” (Ялта, 1996 г.); на "18-то международно групово обучение по услуги за растителна защита" (Тайланд, Банкок, 1996 г.); на IV международна научно-практическа конференция "Нетрадиционно растениевъдство, екология и здраве" (Симферопол, 1997 г.); на VII международна конференция „Биология на растителните клетки in vitro, биотехнология и опазване на генофонда” (Москва, 1997 г.); на заседания на секциите по ягодоплодни култури на Академичния съвет на Всесъюзния държавен икономически институт (1994-1997).

Публикуване на резултатите от изследванията. По материалите на дисертационния труд са публикувани седем научни статии.

Обхват и структура на дисертацията. Дисертацията се състои от въведение, три глави, заключения и препоръки, списък с литература. Текстът на дисертацията е представен на 133 листа машинописен текст, съдържа 26 таблици, 20 бр.

чертежи. Списък на използваната литература в:<лючает 237 наименований, в том числе 120 иностранных.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДИ НА ИЗСЛЕДВАНЕ

Място на изследване. Експериментите са проведени в лабораторията на Биологическия факултет на Ярославския държавен университет. Демидова П.Г. Изходният материал за опитите е получен по стандартния метод за клонално микроразмножаване в лабораторията по биотехнология на отдела за размножаване на овощни и ягодоплодни култури на ВТИСП.

Изследователски обекти. Обект на изследване са сортове ягоди: Mount Everest, Dukat, Geneva, Zenga-Zengana, Profyugen, Rapella, Redgontlit, Tribute, Tristar, Holiday.

условия на отглеждане. Съдовете с експланти се покриват с фолио и свиващо се фолио и се култивират при осветяване от 3000 g, температура 24–26°C и относителна влажност в помещението 70–75%. Източници на светлина: лампи от типа LDC-20 в фара, лампи с нажежаема жичка с мощност 200, 500 W в оранжерията. Осветеността в оранжерията беше 2,5 хиляди лукса сутрин и следобед, 4-5 хиляди лукса в средата на деня.

При специални експерименти, при изследване на ефекта на светлинния период върху регенерираните растения, култивирането се извършва в 8, 12, 16, 24-часов дневен час.

Изследвано е влиянието на минералния и хормоналния състав на хранителните среди върху последващата продуктивност на микроразмножените растения при фотопериод от 16 часа дневна светлина и 1=25°C. Интензитет на осветеност 2500 lx.

Засаждането, презасаждането, разделянето на конгломерати на отделни издънки се извършва при стерилни условия на ламинарна кутия KGO-1 съгласно общоприетите методи.

Състоянието на експлантите се оценява по специално разработена петобална скала.

Хербицидите бяха въведени в хранителната среда преди автоклавиране в следните концентрации, избрани въз основа на резултатите от предварителни експерименти:

а) симазин, който инхибира фотосинтетичния електронен транспорт, който инхибира освобождаването на кислород по време на фотосинтезата;

б) rauvdap, който инхибира синтеза на ароматни аминокиселини.

Като контрола се използва хранителна среда, която не съдържа хербициди.

Засаждането на ягодови епруветки в нестерилни условия се извършва на два етапа:

1, Първо, вкоренени растения от епруветки бяха трансплантирани в перлит и покрити със стъклени съдове, за да се поддържа висока влажност. Постепенно стъклените съдове се отваряха.

2. След това, след около месец, тези ягодови растения бяха трансплантирани в автоклавна почвена смес, която се състоеше от почва, торф и пясък в съотношение 1:1:1, и бяха прехвърлени в отопляема оранжерия.

През май всяка година растенията се прехвърлят в открита земя. Растенията са засадени в почва, покрита с черен мулчиращ материал SUFMK-60.

Сметки и наблюдения. По време на in vitro експериментите бяха взети предвид следните показатели:

1) коефициент на умножение;

2) регенерация на вегетативни органи (листа, пъпки, издънки, корени), като се вземе предвид техният брой на sxplant и броят на експлантите, които са показали морфогенетични реакции;

3) вкореняване на пъпки (или издънки).

В регенеративните инсталации на полето са взети следните показатели:

1) броят на мустаците;

2) броя и площта на листата, броя на рогата, дръжките, цветята,

3) тегло на плодовете;

4) изход на рутирани сокети;

5) промени в морфологията на листата и столоните;

6) наличие на хлорофилни аномалии.

РЕЗУЛТАТИ И ДИСКУСИЯ

Фиг. 1. Реакция на ягодови експланти от различни сортове спрямо продължителността на осветяване. В хода на работата установихме ефекта на режимите на микроразмножаване (8, 12, 16 и 24 часа) върху продуктивността на растенията от различни групи сортове. Най-голям брой издънки имат експланти, отгледани при 24-часов период на осветяване. Средният брой издънки в сортовете от обичайната група (Zgnga-Zengana, Dukat, Redgontlit) за целия период на експеримента е 8,9 - 7,0 - 7,4 броя / експлант, при сортове от ремонтантната група (Mount Everest, Rapella) - 8 - 2 ,9 бр./експлант, при сортове от неутралнодневната група (Тристар, Трибют) - 8,2 - 7,9 бр./експлант. Способността за образуване на издънки на експлантите на Rapella се оказва много ниска при всички светлинни периоди (Таблица 1).

Оценката на състоянието на растенията, образувани от експланти на различни сортове ягоди в зависимост от светлинния режим на отглеждане, показа, че растенията се развиват най-добре при 16-часов период на осветяване, например състоянието на експлантите, отглеждани при 12-часов период на осветяване е 4,2 точки, при 16-часов - 4,7 точки, а при 24-часов - 3,6 точки.

маса 1

Средният брой издънки, образувани от експланти от различни сортове ягоди в зависимост от продължителността на осветяване (бр.)

Сортове Продължителност на осветлението

8 часа/ден 12 часа/ден 16 часа/ден 24 часа/ден

Връх Еверест 4,0 5,3 8,0 15,0

Рапела 2,0 2,8 3,4 3,6

Дукат 4,3 5,0 7,8 11,0

Зенга-Зенгана 4,5 6,3 9,1 14,8

Redgontlite 3.9 5.4 8.0 12.3

Тристар 5,4 6,7 8,5 14,2

Почит 5.6 6.8 9.2 12.1

X 4,0 5,1 7,7 N.9

NSR05 взаимодействие 1.2

Растенията, получени при условия на осветление от 12 и 16 часа, бяха адаптирани към нестерилни условия.

Резултатите от наблюденията показват, че ягодовите растения, отглеждани при 16-часов светлинен период in vitro, произвеждат значително повече столони, отколкото в случай на култивиране при 12-часов ден, а също така имат по-голяма листна площ (Таблица 2,3).

Действието на светлината зависи от образуването на фоторецептори и трансформацията на светлинната енергия в листните клетки, фотостимулация на биосинтетичните процеси в тях.

Както показват нашите проучвания, по-ниското количество пигмент се компенсира от растенията поради по-голямата повърхност на листата.

таблица 2

Среден брой столони в различни сортове ягоди, размножени при различна продължителност на осветление (бр./растение) (1995)

Сортове Продължителност на светлината по време на микроразмножаване

12 часа/ден 16 часа/ден

Връх Еверест 33 ±3,6 40 ±2,8

Rapeala 10 ±2,6 19 ±3,1

Зенга-Зенгана 26 ±3,1 41 ±4,2

Редгонтлит 37 ± 5,2 57 ± 4,6

Дукат 14 ±3,7 24 ±3,5

Трисгар 18 +1,8 21 ±4,1

Племена от 19 ± 1,6 25 ± 4,2

Таблица 3

Влияние на продължителността на деня при ин витро култивиране върху листната площ на ягодовите растения в полето (1 август 1995 г.)

Сортове Листна площ на растение (см2)

12 часа/ден 16 часа/ден

Дукат 240 360

Зенга-Зенгана 550 720

Redgontlite 450 576

Тристар 320 420

HCPos: светлинен режим 24.1 клас 16.4

взаимодействие 18.2 2. Развитието на ягодовите експланти в зависимост от концентрацията на различни форми на азот в хранителната среда. Както е известно, процесът на размножаване in vitro протича върху хранителни среди, от които най-широко се използва средата Мурашиге-Скуг. Тази среда обаче

съдържа някои компоненти (особено азот) в прекомерни концентрации.

Сред минералните соли азотсъдържащите соли са важни за растежа и развитието на растенията.

Изследвахме ефекта от намаляване на състава на хранителната среда Murashige-Skoog с два и четири пъти. Нашите експерименти показаха, че не е препоръчително да се намалява концентрацията на соли в основната среда Murashige-Skoog на етапите на размножаване. Затова се опитахме да оценим концентрациите на различни форми на азот в хранителната среда за развитието на ягодови експланти. Оказа се, че намаляването наполовина на амониевия азот не влияе на коефициента на умножение (Таблица 4).

Таблица 4

Развитие на ягодови експланти от сорта Тристар в зависимост от концентрацията на амониев азот в хранителната среда

KVDO концентрация. Брой издънки, TTGT Дължина на леторастите, w Брой корени, ptg Дължина на корените, mm Брой на листата, mmt.

Cochrole 1650 mg/l 4,3 3,5 2,1 0,5 12,2

0,5. 4,0 3,2 0 0 14,1

0,25 3,9 3,2 0 0 12,2

0,125 3,8 3,0 0 0 11,0

0,5 4,3 3,2 0 0 12,1

0,253 3,9 3,2 0 0 12,1

0,125 3,8 3,2 0 0 10,3

HSRo5 - брой издънки

концентрация NW03 Rf< Роз

Намаляването на нитратния азот от 2 пъти има отрицателен ефект върху способността за образуване на издънки на подвизите. Коефициентът на умножение намалява в сравнение с контролата с 3-4 единици (Таблица 5).

Таблица 5

Развитие на ягодови експланти от сорта Тристар в зависимост от концентрацията на нитратен азот в хранителната среда

Концентрация Количество Дължина

Ютое стреля, стреля,

(част) парче см.

Контрола 1900 mg/l 5.5 2.8

HSRo5 - брой издънки

концентрация на QOL)z = 1,3

Може би този ефект е свързан с механизма на усвояване

нитратен азот. Известно е, че използването на кето киселини за синтеза на аминокиселини става по-интензивно в присъствието на амониев азот в хранителната среда; нитратният азот се използва в по-малка степен за синтеза на аминокиселини.

Въз основа на получените данни може да се заключи, че намаляването на концентрацията на амониев азот с 825 mg/l в средата Murashige-Skoog не води до намаляване на коефициента на умножение, което може да се приложи на практика.

3. Действие на итокинините и ауксините върху развитието на ягодовите експланти. Регулаторите на растежа също са един от важните компоненти на хранителната среда. Внимателният подбор и идентифициране на оптимални концентрации може да подобри ефективността на метода на клонално размножаване.

Изследвахме комбинацията от 6-BAP и кинетин при развитието на експланта. Комбинации от 6-BAP и кинетин в концентрации от 0,25 mg/l + 0,25 mg/l и 0,25 mg/l + 0,5 mg/l, съответно, леко стимулират растежа на пъпките и разгъването на листата (Таблица 6).

Таблица 6

Зависимост на коефициента на умножение от концентрацията на 6-BAP и кинетин в хранителната среда (сорт Zenga-Zengana)

Концентрация на цигокинини, g/l Брой образувани леторасти, бр. Дължина на изстрела, вж

6-BAP кинетин

Контролен 6-BAP 1 mg/l 10.0 2.5

0,25 0,25 3,8 2,0

0,75 0,25 9,2 2,5

1,0 0,25 14,4 2,5

НСРД 4.6 1.2

Най-добри резултати са постигнати при комбинация от 6-BAP-1 mg/l и кинетин – 0,25 mg/l. В този случай броят на образуваните издънки е по-голям, отколкото в контролния вариант.

Най-развитите експланти бяха трансплантирани върху средата за вкореняване. Използването на ауксинови регулатори на растежа в нашите експерименти осигури високо вкореняване на ягодовите издънки на 20-ия ден от култивирането. Сорт Zenga-Zepgtsh се вкоренява еднакво добре при използване на IMC и IUC при концентрации от 0,5-1 mg/l. Сортовете Тристар и Дукат на среда, съдържаща IAA - 1 mg/l в сравнение с контролата имат по-голям брой вкоренени експланти.

4. Чувствителност на пролифериращите ягодови култури към хербициди in vitro. През последните години се обръща повече внимание на възможността за създаване на нови форми на растения чрез биотехнологични методи, по-специално чрез подбор на сомаклонални варианти с икономически ценни признаци. Изборът на сомаклонални варианти на базата на хербицидна резистентност може да се извърши само след откриване на летални и сублетални концентрации на селективни агенти за клетъчни, тъканни и органни култури.

В литературата не открихме такива данни за ягоди, така че следващият етап от работата беше посветен на изследване на чувствителността на култивираните in vitro тъкани и органи на различни сортове ягоди към наличието на два вида хербициди в хранителната среда.

Трябва да се отбележи, че хербиоидният ефект на тестваните препарати е запазен в in vitro култура.

В случай на използване на симазин в концентрационен диапазон 2*10-5 - 2XO 4M се проявява инхибиторен ефект по отношение на растежа и развитието на експлантите. Концентрацията на 10-3M първоначално причинява признаци на хлороза в експланти от всички сортове до пълно обезцветяване, последвано от смърт.

Най-чувствителен към симазин се оказва сортът Женева, за чиито експланти концентрацията на 1CIM се оказва смъртоносна (Таблица 7).

Таблица 7

Състоянието на експлантите на различни сортове ягоди (в точки) в зависимост от наличието на хербициди в хранителната среда (1,5 месеца)

Концентрация на хербицид (M)

Сорт Вид хербицид Контрол (без хербицид) O 2" 10* Yu-" 24 O-5 10-4 2*10-"

Зенга- Симазин 5,0 4,8 4,6 3,8 3,6 2,2

Zengana Roundup 5.0 4.6 4.2 3.0 0 0

Дукат Симазин 5,0 4,8 4,5 4,2 3,8 2,5

Раувдап 5,0 4,4 4,2 3,0 0 0

Редгошлиг Симазин 4,9 4,6 4,4 4,1 3,6 2,4

Обобщение 4,9 4,5 4,0 2,6 0 0

Връх Симазин 4,9 4,5 4,4 3,9 3,8 1,5

Еверест Раувдап 4,9 4,5 3,7 2,4 0 0

Женева симазин 4,8 4,5 4,0 4,2 0 0

Обобщение 4,8 4,5 3,3 1,9 0 0

Трисгар Симазин 4,9 4,6 4,3 4,2 3,8 0

Обобщение 4,9 4,5 3,4 2,7 0 0

Tribiot Simazine 4,9 4,7 4,2 4,1 3,8 1,5

Обобщение 4,9 4,5 3,6 3,0 0 0

При изследване на ефекта от присъствието на Roundup в хранителната среда е установено, че трите най-високи концентрации (10-4, 2*1 (KM, 10-3M) водят до пълна смърт на експлантите.

За да се потвърди намалената чувствителност на избраните експланти, те бяха повторно засадени върху хранителни среди, съдържащи подзаконови концентрации на подходящите хербициди. При последващото култивиране на избрани условно толерантни експланти от различни сортове ягоди, значителна част от културите загиват. Това показва, че в по-голямата част от случаите имаме работа не с устойчиви на хербициди органи и тъкани, а с експланти, които не са имали време да умрат при предишното субкултивиране.

Известно е, че хербицидите потискат много метаболитни процеси в растенията, по-специално те имат значителен ефект върху фотосинтетичната активност.

Симазин инхибира фотосинтезата в растенията, като се свързва с така наречения 32K протеин, който е част от тилакоидната мембрана. Като се има предвид механизмът на хербицидно действие, който се основава на инхибирането на реакцията на Хил, ние проведохме серия от експерименти за нейния ефект върху фотосинтетичната активност.

Глифозатът влияе върху синтеза на много важни ароматни аминокиселини, точката му на приложение е ензимът 3 - фосфошикимат -1 карбоксивинилтрансфераза. Вероятно потискането на този етап на метаболизма причинява дефицит на ароматни аминокиселини, натрупване на шикимат и в резултат на това при контакт с глифозат в концентрация 10-3 М, смъртта на ягодовите експланти.

Така определихме селективните концентрации на два хербицида: симазин - KIM, раундъп - 10-5M.

5. Влияние на симазин и раундъп хербициди върху фотосинтезата на изолирани ягодови леторасти in vitro. В процеса на работа изследвахме ефекта от съдържанието на пигменти в ягодовите листа при култивиране с раундъп и симазин (фиг. 1) Отбелязваме високата чувствителност на експлантите от сорт Женева. Такава повишена чувствителност се отразява и в реакцията на фотосинтетичния апарат към съдържанието на пигменти в ягодовите листа.

На осмата седмица от култивиране във варианта с концентрация на Roundup 2X106M се забелязва стимулиращия ефект на това лекарство върху количеството пигменти в експлантите.

6. Адаптиране на микроиздънките към нестерилни условия в зависимост от времето на<зсадки. Для выявления лучших сроков приживаемости растения земляники каждый месяц переносили в нестерильные условия. Наблюдения, проведённые за дальнейшем развитием таких растений, выявили, что самым благоприятным сроком выведения пробирочных растений был период с мая по август. Например, в 1996 году высокий процент приживаемости был у сортов Тристар - 96%, Трибьют -93%. У сорта Редгонтлит в июле 1996 года на 20% повысилась приживаемость растений по сравнению с 1994 годом этого же месяца. Эксперименты показали, что растение, высаженное в мае-июне-июле быстро развивалось. Так, растения сорта Зенга-Зенгана (Рис.2), перенесённое в нестерильные условия 11 мая с длиной побегов 3,5 см, через 1,5 месяца имело длину побегов 9 см, крупные листья; ещё через месяц растения высаживали в полевые условия. При выведении эксплантов в нестерильные условия в марте, растениям требуется 3,5 месяца для высаживания в полевые условия, а это на один месяц больше, чем в первом варианте.

и 80 -60 -40 -20 -

хлорофил а

хлорофил б

каротеноиди

Фигура 1. Съдържание на пигмент (%) в ягодовите листа, култивирани върху среда с раундъп и симазин в продължение на две седмици.

а) сорт Женева - контрол (без хербициди) върху среда с раундъп I - концентрация 2 10"6 M

б) сорт Женева "CCr - концентрация 10"5 М върху среда със симазин р! - концентрация 10"3 М

Сорт Zenga-Zvngannz

Фиг. 2 Оцеляване на ягодовите растения в зависимост от периода на трансплантация в нестерилни условия (сорт Zenga-Zengana)

Когато ягодовите експланти бяха прехвърлени в нестерилни условия през есента и зимата, степента на оцеляване беше ниска. Например, сортът Zenga-Zengana имаше 70% по-малко вкоренени растения през декември (1996 г.) в сравнение с май (1996 г.); Сорт Дукат има по-малко вкоренени растения през януари: 55% по-малко в сравнение с май (1996). Въз основа на данни за три години (1994-1996) можем да отбележим, че трансплантираните в нестерилни условия през есенно-зимния период експланти са с ниска преживяемост.

Очевидно отбелязаното от нас явление се дължи преди всичко на невъзможността да се поддържат едни и същи условия (осветеност, спектрален състав на светлината) на едно и също ниво в промишлени културни помещения (зимни оранжерии) през цялата година. Забранено е

също така изключва влиянието на вътрешни биологични причини в поведението на растенията, свързани с ритмите на растеж и развитие на растенията.

По този начин степента на оцеляване на растенията при прехвърляне в нестерилни условия зависи от метода и времето на засаждане. Използването на оптимални срокове за прехвърляне на растения в нестерилни условия дава възможност да се увеличи добивът от адаптирани растения до 30%. 7. Икономическа и биологична оценка на растения от различни сортове ягоди, получени по метода in vitro и обичайния метод. Оценявайки икономическото и биологичното значение на сортовете ягоди, сравнихме ефекта на два метода на размножаване на различни сортове върху продуктивността, броя на розетките, теглото на плодовете, броя на засегнатите от гниене плодове (Таблица 8).

Таблица 8

Икономическа и биологична оценка на ягодовите растения, получени чрез различни методи на размножаване ____

Сортове Метод на размножаване Среден добив от растение за година, g Среден брой розетки на растение за 1 година вегетация Среден брой розетки на растение за година на вегетация

Зенга-Зенгана ин витро 126 37 38

стандарт 125 30 37

Redgoitlite in vitro 108 57 52

стандарт 105 40 53

Дукат ин витро 95 18 19

стандарт 99 14 18

Tristar покана 199 21 21

стандарт 183 18 21

tribute invito 186 24 26

стандарт 178 23 25

Женева покана 177 20 19

стандарт 173 21 19

NSR05: сортове 26,5 години 8.9

взаимодействие 5.6

Експериментите показват, че за 1 година отглеждане при някои сортове ягоди броят на розетките зависи от метода на размножаване, например при сорта Zenga-Zengaia броят на розетките от отчетното растение е бил с 8 повече. В сравнение с растенията, получени по конвенционалния метод. През втората година този ефект беше изгладен. Процентът на плодовете, засегнати от гниене, е по-висок при сортове с две плодни вълни: първо, засяга рязкото колебание на нощните и дневните температури през есента в района на Ярославъл; второ, засяга натрупването на патогена в растенията през целия вегетационен период. Нямаше значителни разлики в добива и теглото на плодовете.

Икономически проблеми на размножаването на ягоди in vitro.

Методът на клоново микроразмножаване е доста трудоемък и изисква голямо количество материални разходи. В същото време високата рентабилност на метода in vitro се дължи на спестяването на пространство за отглеждане, намаляването на периода на отглеждане на растенията, увеличаването на коефициента на размножаване, подобряването на качеството на продукта (PSA), както и на работа през есенно-зимния период.

Направена е оценка на икономическата ефективност на производството на посадъчен материал по метода in vitro, като се използва като пример ягодата Zenga-Zengana. Производствените разходи бяха изчислени въз основа на указанията на VSTIS (Таблица 9).

Изчисленията показаха, че с броя на първоначалните експланти - 5 броя, коефициентът на умножение - 8, броят на субкултивациите - 3, като се вземат предвид редица коефициенти (процент на оцеляване на експлантите, добивът на издънки, подходящи за вкореняване, вкореняване ™ , степен на оцеляване по време на адаптация) в рамките на шест месеца според общоприетата технология можете да получите 5000 бр. Изстрелва. Цената на един експлант, отгледан по общоприетата технология, ще бъде 1,22 рубли.

Важен аспект от икономическата ефективност на ин витро технологията беше намаляването на разходите за труд за отглеждане на 1000 бр. ягодови растения in vitro.

Таблица 9

Икономическа оценка на производството на ягодов посадъчен материал с

по метода на клоново микроразмножаване (1 хил. бр.)

Параметри Метод In vitro

1. Цена на 1 единица, търкайте. 1.22

2. Разходи и режийни разходи (180%), руб. 1.68

3. Продажна цена на 1 бр. 7.2

4. Печалба от 1 хил. бр. 5.52

5. Брой микро издънки на 1 m2, бр. 1000

6. Печалба на 1 m2, търкайте. 11.04

6. Ниво на рентабилност, % 328

Така методът на клонално микроразмножаване дава

значителен икономически ефект, което показва предимството на използването му в производството.

1. Продължителността на периода на осветяване оказва значително влияние върху развитието на ягодовите експланти на тестваните сортове. Сред изследваните режими на отглеждане продължителността на осветяване от 12 и 16 часа се оказва най-благоприятна по отношение на коефициента на размножаване, дължината на образуваните издънки, броя на листата, а на етапа на вкореняване - броя и дължината на корените.

2. Ягодовите растения, отглеждани in vitro при 16 часа осветяване, дават значително повече столони, отколкото в случай на култивиране на 12 часа, следователно такива растения могат да се използват като първоначални растения за полагане на маточници. Растенията, отглеждани in vitro при 12-часово осветление, се характеризират с високо съдържание на хлорофили.

a, b и каротеноиди в сравнение с растения, получени на 16-часов ден с 10%-30%.

3. С клоново размножаване на тествани различни сортове ягоди е възможно концентрациите на амониев азот да се намалят наполовина в сравнение с основната среда, без да се влоши такъв показател за развитие като коефициент на умножение

4. За стимулиране на странично разклоняване в експланти на тествани сортове ягоди, комбинацията от 6-BAP в концентрация 1 mg/l с кинетин 0,25 mg/l дава най-добри резултати.

5. Включването на хербициди с различен спектър на действие - раундап и симазин в хранителни среди в концентрации 2X106M - 10"3M - оказва значително влияние върху процесите на растеж при култивирани ягодови експланти. IM Селективната концентрация на симазин е 10 M, раундъп 10 ~ 5 M за тестваните седем сорта ягоди. Тези изследвания могат да станат основа за селекцията на форми на ягоди с повишена устойчивост на хербициди.

6. Наличието на раундъп и симазин хербициди в хранителни среди при концентрации от 105, 10~3М инхибира синтеза на хлорофил а, хлорофил b и каротеноиди. Концентрацията на 2X10-6M раундъп на осмата седмица от култивиране води до повишаване на количественото съдържание на хлорофил а и хлорофил b.

7.0 се определят най-благоприятните условия за прехвърляне на микроразмножени растения в нестерилни условия от май до август, което дава възможност да се увеличи добивът на адаптирани растения с 20% или повече.

8. Оценката на състоянието на растенията на полето показа, че през първата година на отглеждане при растения от сортове Зенга-Зенгана, Дукат, Профюген, Хомдей, Редгонтлит броят на розетките зависи от начина на размножаване. Растенията, отглеждани in vitro, имат около 1,3 розетки повече

пъти. През втората година от вегетацията различията в броя на образуваните розетки при всички изследвани сортове ягоди бяха изгладени. Няма съществени разлики в добива на изследваните сортове в зависимост от начина на размножаване.

При размножаване на ягодови растения in vitro препоръчваме намаляване на концентрацията на амониев азот до 825 mg/l в хранителната среда Murashige-Skoog. За да се осигури масовото размножаване на леторастите, оптималната комбинация от регулатори на растежа 6-BAP и кинетин е съответно 1 mg/l, 0,25 mg/l.

Трансплантацията на растения от епруветки в нестерилни условия трябва да се извършва от май до август.

За подбор на сомаклонални варианти и трансгенни екземпляри с повишена хербицидна устойчивост се използват следните концентрации на хербициди в хранителната среда: rauvdapa - 2X10"5, Yu"5M; симазин - 2M0 "4, 1 (NM.

1. Khapova S. A. Влияние на условията на отглеждане върху клоновото микроразмножаване на ягодата и процесите на нейното адаптиране към нестерилни условия // Резюме на Всеруската конференция "Млади учени за градинарството в Русия". - М. -1995. - С.156-158

2. Khapova S.A. Ефект на хербицидите върху фотосинтезата и развитието на експлантите

ягоди ин витро // Сборник с доклади от IV международна конференция „Проблеми на дендрологията, цветарството, овощарството, лозарството и винарството”. -Ялта, -1996.-Т.2.-С.61-63

3. Хапова С. Тъканна култура strawbeny no virus // 18-то международно групово обучение по

услуги за растителна защита. -Тайланд. -1996 г. - Т. 1. - P.M-M3

4. Висоцки В.А., Хапова С.А. Чувствителност на култури от изолирани ягодови органи към хербициди / сб. работа. VSTISP. - М.; -1997 г. - С.83-89

5. Khapova S.A. Влиянието на състава на субстрата и времето на трансплантация в нестерилен

условия за оцеляване на ягоди от епруветка ratsenia // Резюме на докладите от научната конференция YarSHA. - Ярославъл. -1997 г.

6. Khapova S.A. Реакцията на изолирани ягодови издънки към наличието на хербициди в хранителната среда // Резюме на VII международна конференция „Биология на растителните клетки in vitro, биотехнология и опазване на генофонда”. -1997 г. - С.382-383

7. Khapova S.A. Влияние на светлинния режим върху морфологията и синтеза на пигментите

ягодови растения в полето // Сборник с доклади от VI международна научно-практическа конференция „Нетрадиционно растениевъдство, екология и здраве”. - Симферопол. -1997 г. - Т. 1-2. - с. 140-141

За експерименти in vitro е използвана цяла кръв на 11 клинично здрави доброволци и 36 пациенти с термично нараняване.

2.3. Изследователски методи

2.3.1. Имунологични методи за изследване

2.3.1.1. Оценка на спонтанна и индуцирана секреторна активност на мононуклеарни клетки от периферна кръв in vitro

Обект на изследването е венозна кръв, взета от здрави доброволци и от пациенти с термично увреждане сутрин на празен стомах. Кръвта се стабилизира с хепарин със скорост 10 IU/ml. Фракцията от мононуклеарни клетки се изолира съгласно метода при градиент на плътност от 1,077 g/ml чрез центрофугиране (400 g за 45 минути) с използване на ficoll и verografin. За образуване на среда с плътност 1,077 g/cm3 са използвани 9% (w/v) ficoll-400 разтвор (Diam, Москва) и 60% официален урографин (Schering, Германия). Опалесцентният пръстен от мононуклеарни клетки се взема от интерфазата с пипета на Пастьор и се промива три пъти чрез центрофугиране със среда 199 при 689 g за 5-7 минути. Промитите и ресуспендирани клетки се регулират до концентрация от 1 х 107 клетки/ml. Тяхната жизнеспособност се оценява чрез оцветяването им с 0,2% разтвор на трипаново синьо, жизнеспособността е най-малко 98%.

Култивирането на клетките се извършва при 5% въглероден диоксид във въздуха при температура 37°С за 1 час. При стерилни условия съдържанието на клетките се аспирира, последвано от две промивки от неприлепнали клетки с разтвор на Ханк. След това към всяка ямка се добавят 250 μl 10% фетален телешки серум и 80 μg/ml гентамицин. След това клетките се култивират в продължение на 72 часа, при термостатични условия при 5% въглероден диоксид във въздуха, при температура 37°С, концентрацията на цитокини се определя в супернатанта.

2.3.1.2. Изследване на вродения имунитет

Определяне на броя на левкоцитите и левкоцитната формула.Броят на левкоцитите в периферната кръв се определя по конвенционалния метод на меланж в камерата на Горяев. Формулата на левкоцитите се изчислява в кръвни намазки, фиксирани с метилов алкохол и оцветени с лазур II-еозин по Romanovsky-Giemsa. Преброени са 200 левкоцита с диференциация на еозинофили, базофили, метамиелоцити, прободни и сегментирани неутрофили, лимфоцити, моноцити. Техният брой се изразява в относителни (%) и абсолютни (10 9 /l) стойности.

Функционалната активност на фагоцитите е изследвана по отношение на NBT-теста и фагоцитозата.

Изследване на абсорбционния капацитет на фагоцитите на периферната кръвбеше проведено върху модел на абсорбция на латексни частици. За да се оцени фагоцитозата, 200 μl кръв се смесва с 20 μl суспензия от частици от монодисперсен (диаметър 1,7 μm) полистиренов латекс. След 60 минути инкубация при температура 37°С от суспензията се приготвят препарати, които се сушат, фиксират с метанол и се оцветяват с лазур II - еозин по Романовски-Гимза. Използвана е имерсионна микроскопия, за да се вземе предвид активността на фагоцитозата - % клетки, които са уловили поне една латексна частица, интензитетът на фагоцитозата - броят на абсорбираните латексови микросфери в 100 преброени клетки и фагоцитното число - броят на абсорбирания латекс микросфери на фагоцит.

NST-тесте проведено, като се вземе предвид интензивността на редукция на нитросиния тетразолий (NBT) от фагоцитите в неговата неразтворима форма - диформазан по метода на A.N. Маянски и М.Е. Виксман (1979). Проведен е спонтанен и индуциран NBT-тест.

В епруветки с 0,2 ml кръв се добавят 0,1 ml 0,2% разтвор на стандартен разреден нитросин тетразолий в 0,1 М фосфатен буфер (рН 7,4). За оценка на индуцирания HCT тест, 20 μl от суспензия от частици от монодисперсен (диаметър 1,7 μm) полистиренов латекс (индуцирана серия) или 20 μl 0,9% NaCl (спонтанна серия) се добавят към всяка ямка. След 30-минутна инкубация при температура 37°С към реакционната смес се прибавят 3 ml 0,1% солна киселина, за да се спре реакцията. Епруветките се центрофугират при 1000 rpm за 5 минути. Супернатантата се изхвърля, приготвят се намазки от утайката. След изсушаване препаратите се фиксират с метанол и се оцветяват в продължение на 5 минути с 0,1% воден разтвор на сафранин. Използвайки микроскопия при увеличение 90x10x1,5, ние определихме процента клетки, които възстановяват NBT и интензитета на реакцията според активността на NBT редукция, за която NBT-позитивните клетки бяха разделени на 3 групи:

1 - клетки с гранули диформазан в цитоплазмата с обща площ по-малка от 1/3 от площта на ядрото;

2 - клетки с диформазан гранули в цитоплазмата над 1/3 от площта на ядрото;

3 – клетки с гранули на диформазан, по-големи от ядрото.

За да се получи коефициентът на интензивност на реакцията, броят на клетките в първата група, изразен като процент, се умножава по 1, втората група - по 2, третата - по 3, резултатите се сумират и разделят на 100.