Цел на урока:да проучи основните серотипове на Salmonella и да обоснове необходимостта от тяхната типизация, да разработи методи за биохимична и серологична типизация на Salmonella.

Работен план:

    Определете рода на патогените на хранително отравяне, като изследвате културите върху среда от къс пъстър ред и на агар с три захари.

    Разгледайте основните серотипове на Salmonella и обосновете необходимостта от тяхната типизация.

    Извършване на биохимична типизация на патогени на Salmonella чрез изучаване на култури върху среди от дълга пъстра серия.

    Извършете серологично типизиране на Salmonella с помощта на аглутиниращи серуми на Salmonella.

    Помислете за ветеринарно-санитарната оценка на патогените, пренасяни с храна.

Материална подкрепа:среда с инокулации, направени от учениците в предишния урок, 10 епруветки, пипети, предметни стъкла, бактериологична бримка, бактериологичен мост, кисело мляко, газова горелка (алкохол), комплекти от диагностичен аглутиниращ комплекс Salmonella и монорецепторни серуми, таблици (“ Растеж на патогени в храната, токсични инфекции на дълъг пъстър ред”, „Схема за серологично типизиране на салмонела”, „Състав на първия комплект диагностични серуми за салмонела”), дестилирана вода, разтвор за дезинфекция на ръце, етилов алкохол.

Основни серотипове салмонелаи тях практическа стойностПонастоящем са известни повече от 2000 серотипа на Salmonella. Най-патогенни за човека и много видове домашни животни са: S. typhi murium, за говедата S. Dublin, S. enteritidis; за прасета: S. cholerae suis, S. typhi suis; за птици: S. gallinarum, S. pullorum. Всички горепосочени серотипове на Salmonella са патогенни или условно патогенни за хората. Салмонелите са силно устойчиви на термична обработка и могат да се задържат в месо и други храни за дълго време. Освен това трябва да се отбележи, че бактериите от рода Salmonella

имат предимно захаролитични свойства и практически не отделят протеолитични ензими, поради което органолептичното изследване на замърсените продукти обикновено не разкрива видими промени. Тези свойства на Salmonella допринасят за широкото разпространение на това хранително отравяне.

Значение на типизирането на салмонела и други хранителни патогени

Типизирането на патогените на хранителните отравяния е необходимо, за да се установи патогенността на този патоген за хора и други животински видове; за идентифициране на източника на хранително отравяне; разработване на оптимални методи за лечение на хранителни отравяния и подбор на най-ефективните антибиотици и терапевтични серуми; за профилактика на салмонелоза и колибацилоза във фермите и оптимален подбор на ваксини и серуми.

Биохимична типизация на причинителите на хранително отравяне

в сряда дълъг пъстър ред

Биохимичното типизиране се основава на разликите в определени ензими на Salmonella. Поради ензимните различия някои бактерии са в състояние да разграждат определени въглехидрати или алкохоли, докато други не. За биохимична типизация се използват среди от дълга пъстра серия. За да направите това, е необходимо да се вземе предвид растежа на хранителни патогени на дълъг пъстър ред. Ако изследваният патоген разгради определена захар, тогава по време на нейното разпадане се отделят различни киселини, рН на неговата среда става киселинно, а индикаторът на Андре оцветява средата в червено. Ако захарта не се разгради, тогава средата остава жълта и реакцията се счита за отрицателна. След като се вземе предвид реакцията, получените резултати се сравняват с биохимичните свойства на причинителите на хранително отравяне (виж Таблица 5) и се идентифицира специфичен серотип на бактерията чрез метода за елиминиране.

Ако според резултатите от изследването се окаже, че два или повече серотипа на Salmonella имат едни и същи биохимични свойства, тогава може да се използва един от следните методи за типизиране на патогена: удължаване на пъстрия ред (повторно засяване върху His среда с онези захари, които се разцепват по различен начин от сравняваните серотипове на Salmonella); за провеждане на серологични реакции с монорецепторни серуми, реагиращи със сравнени серотипове на Salmonella. Установяването на серотипа на Salmonella може да бъде улеснено чрез логически анализ (епизоотичното състояние на населеното място, географията на разпространение на сравняваните серотипове, тяхната патогенност за този вид животни).

Биохимичната типизация на бактериите от родовете E. Coli и Proteus се извършва по подобен начин (виж Таблица 6).

Лекция номер 14.Семейство Enterobacteriaceae . род салмонела .

Обща характеристика на семейство Enterobacteriaceae.

Бактериите от това семейство са най-честите причинители на чревни инфекции. Те споделят редица общи черти. Това са къси, неспорообразуващи пръчки със заоблени краища, подвижни (перитрихи) или неподвижни, някои имат капсули. Аероби или факултативни анаероби. Характерно е отрицателно оцветяване по Грам. Те растат добре на обикновени хранителни среди с месен екстракт. В повечето плътни среди ентеробактериите образуват кръгли, изпъкнали, лъскави S- (гладки) колонии, както и плоски, неравномерни и гранулирани R- (груби) форми, често поради загуба на капсулата. Те се характеризират с ферментация на глюкоза (и други въглехидрати) с образуване на киселина и газ. По отношение на лактозата те се делят на лактозоферментиращи и лактозо-неферментиращи. Каталаза - положителна, възстановява нитратите до нитритите.

Семейство Enterobacteriaceae включва повече от 20 рода, обединяващи повече от 100 вида бактерии, живеещи в почвата, върху растенията, които са част от микробните биоценози на червата на животните и хората. Най-голямо значение за човека имат родовете Escherichia, Salmonella, Shigella, Yersinia, Proteus, Klebsiella и др. За диференциацията на родовете се използват основно биохимични признаци, за класификация в рамките на родове и видове, изследване на антигенната структура ( О-, Н- и К-антигени).

O антиген.представени от липополизахариди (LPS) на външната мембрана. Щамове без O антиген образуват R колонии и обикновено са авирулентни.

Н- антиген -термолабилни протеини присъстват само в подвижни (с флагели) видове.

К- антиген- термостабилни полизахариди на капсулата и външната обвивка.

В патогенезата на лезиите, причинени от ентеробактерии, важни са LPS (ендотоксин, освободен при унищожаването на бактериите), различни ентеротоксини, инвазивни и адхезионни фактори (флагели и др.) и ензими за патогенност.

родсалмонела.

Салмонелата е голяма група ентеробактерии, сред които са различни серотипове - причинителите на коремен тиф, паратиф А, В и С и най-често срещаните хранителни заболявания - салмонелоза. Въз основа на патогенност за хората салмонелата се разделя на патогенни за човека - антропонози (причиняват коремен тиф и паратиф А и В) и патогенни за хората и животните - зоонози (причиняват салмонелоза). Въпреки значителните различия в антигенните характеристики на Salmonella, биохимичните свойства, причинените от тях заболявания, според съвременната, но не достатъчно удобна и съвършена класификация, се разграничават два вида - S.bongori и S.enteritica. Последният се разделя на подвидове, от които най-важни са подвидовете choleraesuis и salamae. Подвидът choleraesuis съдържа най-голямата част от известните серовари на Salmonella (около 1400 от около 2400).

Морфология.Прави грам-отрицателни пръчици с размери 2-4 x 0,5 µm. Подвижен поради наличието на перитрихозни флагели.

Културни и биохимични свойства.Факултативните анаероби растат добре на прости хранителни среди. Оптимално рН - 7,2-7,4, температура - +37. Метаболизъм – окислителен и ферментативен. Салмонела ферментира глюкоза и други въглехидрати, за да произвежда киселина и газ (серотип на Salmonella typhi не причинява газове). Обикновено не ферментират лактоза (на среда с този въглехидрат - безцветни колонии), захароза. Оксидаза отрицателна, каталаза положителна. Реакцията на Фогес-Проскауер е отрицателна.

Въз основа на биохимичните (ензимни) свойства салмонелите са разделени на четири групи. Характерни признаци на салмонела - производство на сероводород, липса на производство на индол и аеробност. За изолиране се използват диференциално диагностични среди (бисмут-сулфитен агар, Endo, Ploskirev, SS агар) и обогатителни среди (селенит бульон, жлъчен бульон, среда на Рапопорт). S-формите образуват малки (от 1 до 4 mm) прозрачни колонии (на среда Ендо - розови, на среда на Плоскирев - безцветна, на бисмут - сулфитен агар - черна, с метален блясък). В течна среда S-формите дават равномерна мътност, R-формите се утаяват.

Антигенна структура.Разпределете O-, H- и K- антигени. Групата на К-антигените включва Vi-антигени (вирулентни антигени). Поради по-повърхностното си местоположение (от О-антигените), Vi-антигенът може да предотврати аглутинацията на културите на Salmonella чрез O-специфичен серум (щита). За диференциране на салмонела се използва схема (серологична класификация) Кауфман - Бял.

Според структурата на О-антигените салмонелата се разделя на О-групи(67 серогрупи), всяка от които включва серологични видове, различаващи се по структурата на Н-антигените. Принадлежността на Salmonella към определен серовар се установява чрез изследване на антигенната структура в съответствие със схемата на Kaufmann-White. Примери: серотип S.paratyphi A принадлежи към серогрупа A, S.paratyphi B - към серогрупа B, S.paratyphi C - към група C, S.typhi - към серогрупа D.

фактори на патогенност.

1. Фактори на адхезия и колонизация.

3.Ендотоксин (LPS).

4. Термолабилни и термостабилни ентеротоксини.

5. Цитотоксини.

6. Вирулентните плазмиди и R-плазмидите са от съществено значение.

7. Vi - антигенът инхибира действието на серумните и фагоцитните бактерицидни фактори.

Основните фактори на патогенност на Salmonella са способността им да проникват в макрофагите и да се размножават в лимфоидните образувания на слизестия слой на тънките черва (Пейерови петна, единични фоликули), както и производството на ендотоксин.

Патогенезата на лезиите.Различията в клиничните форми на заболявания, причинени от Salmonella, зависят от вирулентността и дозата на патогена и състоянието на имунната система на организма. Обичайната доза, която предизвиква клинични прояви е 10 6 - 10 9 бактерии, по-малка доза е достатъчна за имунодефицити, хипохлорхидрия и други заболявания на стомашно-чревния тракт.

Има следните основни форми на инфекция със Salmonella:

Стомашно-чревни;

Генерализирани (тифоподобни и септикопиемични варианти);

Бактерионосител (остър, хроничен, преходен).

Значимите патогенетични особености на инфекциозния процес, причинен от серотипове S.typhi, S.paratyphi A,B, са в основата на обособяването на коремен тиф и паратиф в самостоятелна нозологична група. Всяка фаза на патогенезата съответства на клиничния период на заболяването и собствената си тактика на лабораторно изследване. Основните фази са въвеждане на патогена (съответстващо на инкубационния период), първична локализация на патогена (продромален период), бактериемия (първата седмица от заболяването), вторична локализация на салмонела (височината на заболяването е 2-3 седмици), екскреторно-алергични (реконвалесценция - 4 седмици от заболяването).

Влизайки през устата, салмонелата навлиза в епителните клетки на дванадесетопръстника и тънките черва чрез ендоцитоза. Те лесно проникват в епителните клетки, но не се размножават тук, а преминават и се размножават в лимфния апарат на тънките черва. Салмонелите се размножават главно в lamina propria (първична локализация), което е придружено от локална възпалителна реакция на лигавицата, приток на течност в лезията и развитие на диариен синдром (гастроентерит). Ентеротоксините повишават нивото на цикличния аденомонофосфат (цАМФ), има повишаване на нивото на хистамин и други биологично активни вещества, съдова пропускливост. Наблюдават се водно-електролитни нарушения, развиват се хипоксия и ацидоза, които се влошават. патологичен процесс преобладаване на съдови нарушения. Има унищожаване на част от Salmonella с освобождаване на ендотоксин, сенсибилизация (ХЗТ) на лимфния апарат на тънките черва.

От лигавицата салмонела може да навлезе в лимфата и по-нататък в кръвния поток, причинявайки бактериемия. В повечето случаи е с преходен характер, т.к. Салмонелите се елиминират от фагоцити.

За разлика от други салмонели, причинителите на коремен тиф и паратиф, прониквайки в кръвния поток, са в състояние да оцелеят и да се размножават във фагоцити. Те могат да се размножават в мезентериалните лимфни възли, черния дроб и далака и да предизвикат генерализиране на процеса. След смъртта на фагоцитите салмонелите отново навлизат в кръвния поток. В същото време Vi-антигенът инхибира бактерицидните фактори.

Когато салмонела умира, се отделя ендотоксин, който инхибира дейността на централната нервна система(тиф - от гръцки. typhos - мъгла, объркано съзнание) и предизвикваща продължителна треска. Действието на ендотоксина може да причини миокардит, миокардна дистрофия, инфекциозно-токсичен шок.

В резултат на бактериемия се получава генерализирана инфекция на жлъчния мехур, бъбреците, черния дроб, костния мозък и твърдата мозъчна обвивка (вторична локализация на Salmonella). Има вторична инвазия на чревния епител, особено на пейеровите петна. В стената, сенсибилизирана от салмонела, се развива алергично възпаление с образуването на основното страшно усложнение - язви на коремен тиф. Дългосрочно пренасяне на салмонела в жлъчен мехурс освобождаването на патогена с изпражнения, пиелонефрит, кървене и перфорация на червата с поражение на пейеровите пластири. След това има формиране на постинфекциозен имунитет, елиминиране на патогена и заздравяване на язви или образуване на бактерионосител (в Западен Сибир, често на фона на хронична описторхоза).

Причинителите на салмонелозата са други серотипове на Salmonella, които са патогенни за хората и животните (S.typhimurium, S.enteritidis, S.heldelberg, S. newport и др.). Патогенезата на салмонелозата се основава на действието на самия патоген (взаимодействието му с организма гостоприемник) и ендотоксина, който се натрупва в хранителните продукти, заразени със салмонела. В класическата версия токсичната инфекция със Salmonella е гастроентерит. При нарушаване на лимфната бариера на червата обаче могат да се развият генерализирани и извънчревни форми на салмонелоза (менингит, плеврит, ендокардит, артрит, абсцеси на черния дроб и далака, пиелонефрит и др.). Увеличаването на генерализираните и извънчревни форми на салмонелоза е свързано с увеличаване на броя на имунодефицитните състояния, което е от особено значение при HIV инфекцията.

Отделен проблем представляват болничните щамове на Salmonella (по-често индивидуални S. typhimurium fagovars), които причиняват огнища на нозокомиални инфекции предимно сред новородени и изтощени деца. Предават се предимно по битов контакт от болни деца и бактерионосители, имат висока инвазивна активност, често причиняват бактериемия и сепсис. Епидемичните щамове се характеризират с множествена лекарствена резистентност (R-плазмиди), висока устойчивост, включително към високи температури.

епидемиологични особености.Характеризира се с повсеместно разпространение. Основните резервоари на Salmonella са хората (причинители на коремен тиф и паратиф А) и различни животни (други серотипове на Salmonella). Основните патогени са полипатогенни. Основните източници на инфекция са месото и млечните продукти, яйцата, домашните птици и рибните продукти. Основните начини на предаване са храна и вода, по-рядко - контакт. Характерно е изключително множество резервоари и възможни източници на инфекция. Селскостопанските животни и птици са от първостепенно значение.

Лабораторна диагностика.Основният метод е бактериологичен. Въз основа на патогенезата оптималните срокове за бактериологични изследвания при гастроинтестинални форми са първите дни, при генерализираните форми - края на втората - началото на третата седмица от заболяването. При изследване на различни материали (изпражнения, кръв, урина, жлъчка, повръщане, хранителни остатъци) най-висока честота на положителни резултати се наблюдава при изследването на изпражненията, за причинителя на коремен тиф и паратиф - кръв (хемокултура).

Изследването се извършва по стандартната схема. Изследваният материал се инокулира върху плътни диференциално диагностични среди - силно селективни (бисмут сулфитен агар, брилянтно зелен агар), средно селективни (среда на Плоскирев, слабо алкален агар), нискоселективни (Ендо и Левин агари) и обогатителни среди. Средата на Рапопорт се използва за хемокултура. Върху бисмут-сулфитен агар колониите на Salmonella придобиват черен (рядко зеленикав) цвят.Порасналите колонии се култивират в среда за първична (Ressel среда) и биохимична (сероводород, урея, глюкоза, лактоза) идентификация. За предварителна идентификация се използва фаг O1-Salmonella, към който са чувствителни до 98% от Salmonella.

За идентифициране на култури при RA се използват поливалентни и моновалентни O-, H- и Vi- антисеруми. Първо се използват поливалентни адсорбирани O и H серуми, а след това съответните моновалентни O и H серуми. За идентифициране на причинителите на коремен тиф и паратифи се използват антитела срещу антигена O2 (S.paratyphi A), O4 (S.paratyphi B), O9 (S.typhi). Ако културата не аглутинира с O-серум, трябва да се изследва с Vi-серум. За бързото откриване на салмонела се използват поливалентни луминесцентни серуми.

Серологичните изследвания се извършват за диагностициране, както и идентифициране и диференциране на различни форми на носител. Приложете RA (реакция на Видал) с O- и H- диагностикуми и RPHA, като използвате поливалентни еритроцитни диагностикуми, съдържащи полизахаридни антигени от серогрупи A, B, C, D и E и Vi-антиген.

Лечение- антибиотици (левомицетин и др.). Често се откриват щамове, устойчиви на антибиотици. Необходимо е да се определи антибиотичната резистентност на изолирани култури.

Специфична профилактикаможе да се използва предимно за коремен тиф. Нанесете адсорбирана с химикали тиф моноваксина. Понастоящем ваксинацията се използва главно за епидемични индикации.

Към месо-пептонния бульон се добавя 3-4% агар, рН се довежда до 7,6, излива се в колби от 100 ml и се стерилизира, както обикновено, в автоклав, като се държи в тази форма до приготвянето на фуксин-сулфитния агар. Пригответе фуксин сулфитен агар в деня на употреба. Невъзможно е да се подготвите за бъдещето и да съхранявате тази среда, тъй като тя бързо става червена.

Към 100 ml разтопен и охладен до 70°C 3-4% месо-пептонен агар се прибавя стерилно 1 g лактоза, като предварително се разтваря и се вари в 5 ml стерилна вода. Освен това тук се добавят и 0,5 ml филтриран наситен алкохолен разтвор на основен фуксин и 2,5 ml прясно приготвен 10% разтвор на натриев сулфат. Натриевият сулфит (Na2SO3) в количество 0,5 g се разтваря в 5 ml вода и се стерилизира чрез кипене преди употреба.

Можете да го направите малко по-различно. Фуксин и натриев сулфит първо се смесват в епруветка: разтвор на натриев сулфит се добавя към 0,5 ml разтвор на фуксин при разклащане, докато течността в епруветката стане безцветна или леко розова. И тази смес се изсипва в разтопения и малко охладен агар. Колбата със средата се разклаща добре, за да се смеси и средата се излива в петриеви блюда. След втвърдяване на средата, тя се суши в термостат при 37°С за 30 минути.

Когато е гореща, средата трябва да е леко розова на цвят, а след охлаждане напълно безцветна. Обезцветяването на фуксина в околната среда на Ендо се причинява от въведения натриев сулфит.

Симънс сряда

При идентифициране на микроби от групата на coli (за разграничаване на почвените видове Escherichia coli aerogenes от фекалните видове Escherichia coli commune) се използва цитратна среда на Симънс. В 1 литър дестилирана вода се разтварят 1,5 g натриев фосфат (или монозаместен амониев фосфат), 1 g монозаместен калиев фосфат (KH2PO4), 0,2 g магнезиев сулфат, 2,5-3 g кристален натриев фосфат - 7 pH.27 0. , добавете 2% агар и след разтопяване на средата я изсипете в колби от 100 ml. Стерилизира се в автоклав за 15 минути при 120°C.

Преди употреба към средата трябва да се добави индикатор. Може да се използва или бромтимол синьо, или фенолрот. Индикаторът се добавя към 100 ml от разтопената среда. Bromothymolblau се приема в количество от 1 ml 1,5% алкохолен разтвор. Средата става маслиненозелена. Добавя се фенолрот в количество от 2 ml 1,5% алкохолен разтвор. Средата става жълта. След добавяне на индикатора средата се излива в епруветки и се стерилизира в автоклав при 120°С за 15 минути.

Пъстра серия от въглехидрати или околната среда на Хис

Средите на Giss се използват за определяне на ензимната способност на микроорганизмите. В зависимост от наличието на един или друг ензим в микробната клетка, тя е в състояние да разложи всеки един от въглехидратите с образуването на определени продукти на разлагане, следователно всеки въглехидрат се въвежда в средата: лактоза, глюкоза, манитол, захароза, и т.н. Набор от такива среди е получил името на "пъстра серия от въглехидрати".

Първо се приготвя пептонна вода: 10 g пептон и 5 g химически чиста готварска сол се вземат за 1 литър дестилирана вода, варят се, докато пептонът се разтвори, филтрира се през хартиен филтър (филтратът трябва да е напълно прозрачен) и се задава pH 7.2-7.4. След това към 100 ml пептонна вода се добавят 0,5 g един от използваните въглехидрати и 1 ml индикатор Andrede.

Съставът на индикатора Andrede включва: 0,5 g кисел фуксин, 16 ml 1 N. разтвор на натриев хидроксид (NaOH) и 100 ml дестилирана вода. При необходимост индикаторът може да се подготви предварително и да се съхранява на тъмно място след кипене при 100 °C за 15 минути. След въвеждането на индикатора средата се излива в епруветки с поплавъци и се стерилизира в котел на Koch три пъти за 30 минути. В края на стерилизацията плувките трябва да бъдат потопени в среда в противен случайфлаконът не може да се използва. Средите за муха с реактива на Андре са сламеножълти на цвят без розов нюанс. С развитието на микроорганизми в околната среда, последните, разлагайки захарта с образуването на киселина, предизвикват промяна в реакцията. И тъй като индикаторът Andrede става червен в кисела среда, това е доказателство, че микроорганизмът използва тази захар за живота си. Липсата на зачервяване, напротив, показва отсъствието в ензимния комплекс на изследвания микроб на ензим, който разгражда въглехидрата, присъстващ в средата.

Ензимната активност на микроорганизмите е богата и разнообразна. Позволява ви да установите принадлежността към вида и вида, да определите биологичните варианти на микроба. Съществуват редица ензими, чиято активност може да определи степента на патогенност на даден микроорганизъм.

За определяне на ензимната (биохимична) активност на микробите се използват диференциално диагностични среди.

Диференциално-диагностичните среди включват среди на Giss, върху които се изследва захаролитичната активност на микроорганизмите.

Медиите за шипване могат да бъдат течни или твърди. Основата на средата на Giss е месо - пептонен бульон (MPB) и месо - пептонен агар (MPA). Тези среди включват въглехидрат и индикатор. Има две серии медии на Giss - големи (включително 27 артикула) и малки. Малка гама от Hiss среди включва малтоза, глюкоза, захароза, примамки и лактоза. Първоначалната настройка на pH на средата е слабо алкална (7,2 - 7,4).

Ако по време на култивирането на микроби субстратът се разгради до киселина, тогава рН на средата се променя към киселинната страна и в същото време се променя цветът на индикатора. Промяната в цвета на хранителната среда е индикатор за наличието на ензим в даден микроб, който разгражда специфичен субстрат до киселина. Както в течна, така и в гъста хранителна среда, наличието на ензим, който разгражда субстрата до киселина, се преценява по промяна в цвета на индикатора.

Образуването на газ се определя от натрупването на газови мехурчета в дебелината на агара и от разкъсването на агара (ако средата His е гъста) или от натрупването на газови мехурчета в поплавъка (ако средата е течна) . Поплавъкът е тясна стъклена епруветка със затворен край, обърнат нагоре, която се поставя в епруветка със среда, преди средата да бъде стерилизирана.

Разликата в набора от ензими, които разграждат въглехидратите, може да се използва при диференциацията на сродни микроби, например Salmonella, Shigella, Escherichia. И така, на среда Ендо, Левин, Плоскирев, която включва лактоза и индикатор (анилиново багрило), колониите на Escherichia coli ще станат лилави (на среда на Левин) или люляк (на среда Ендо и Плоскирев). Колониите от Salmonella и Shigella върху една и съща среда ще бъдат безцветни.

Това се дължи на факта, че Escherichia coli, притежаваща ензима лактаза, разгражда лактозата, което води до образуването на киселина, рН на средата се измества към киселинната страна и се появява цветът на индикатора, анилиновото багрило. Екземплярите от Coli се оцветяват добре с анилиново багрило, а колекцията от оцветени индивиди представлява оцветена колония.

Shigella и Salmonella нямат ензима лактаза и не разграждат лактозата, pH на средата не се променя, индикаторът не се появява, микробните клетки не се оцветяват. Следователно колониите на Salmonella и Shigella върху среда Endo и Ploskirev ще бъдат безцветни.

Наличието на ензима амилаза може да се прецени чрез засяване на културата върху среда, съдържаща нишесте. Ако има ензим, който разгражда нишестето, тогава когато към епруветката се добави капка разтвор на Лугол, средата няма да стане синя. Неразложеното нишесте, когато се добави с разтвор на Лугол, дава син цвят.

Протеолитичните свойства (т.е. способността за разграждане на протеини, полипептиди и др.) се изследват върху среди с желатин, мляко, суроватка, пептон. С растежа на желатин-ферментиращи микроби върху желатиновата среда, средата се втечнява. Естеството на втечняването, причинено от различни микроби, е различно.

При разделяне с пептон може да се отделят индол, скатол, сероводород, амоняк. Формирането им се установява с помощта на индикатори. Например филтърната хартия се импрегнира предварително с индикаторен разтвор, изсушава се, нарязва се на тесни ивици с дължина 5–6 cm и след засяване на културата върху BCH се поставя под тапата (между тапата и стената на епруветката). След инкубиране в термостат вземам предвид резултата. Амонякът кара лакмусовата хартия да стане синя; при отделяне на сероводород върху лист хартия, напоен с 20% разтвор на оловен ацетат и натриев бикарбонат, се образува оловен сулфат - черна сол, а индикаторната хартия става черна. Индолът допринася за зачервяването на лист хартия, напоен с разтвор на оксалова киселина.

Хемолитичните свойства на микробите могат да бъдат открити с помощта на кръвен агар. Ако микробът има ензима хемолизин, тогава около колониите на този микроб ще има зони на еритроцитен лизис (в тези зони агарът ще бъде безцветен).

Ензимът лецитиназа се открива чрез инокулация на културата върху жълтъчен солев агар. Около колонията на микроба, който произвежда този ензим, се образува матов ореол.

Трябва да се помни, че наличието на различни ензими определя биохимичните свойства на микробите.

Културни и биохимични свойства на причинителите на хранителни отравяния

Ензимният състав на всеки микроорганизъм е доста постоянна характеристика при нормални условия, т.е. различните видове микроорганизми се различават по набора от ензими.

Изучаването на ензимния състав е важно за диференциацията и идентифицирането на различни микроорганизми.

Специални методи за оцветяване на бактерии.Методите на Грам и Зийл-Нилсен са намерили най-голямо разпространение.

Методи за диференциранеобикновено се използва за оцветяване на различни морфологични структури.

Капсули.Методите на Hiss, Leifson и Anthony се използват за оцветяване на бактериални капсули; последният метод е най-простият и включва оцветяване с кристално виолетово, последвано от третиране с 20% воден CuSO4.

Жгутици.За оцветяване на жгутици са предложени методите на Löffler, Bailey, Grey и др. Тези методи се характеризират с първоначално ецване на препарата и последващо оцветяване (по-често карболов фуксин на Ziehl).

Спорове.Бактериалните спори се оцветяват след предварителна обработка на стените им. Най-простият е методът на Пешков, който включва изваряване на намазка със синьото на Льофлер върху предметно стъкло, последвано от оцветяване с неутрално червено. Спорите оцветяват в синьо, вегетативните клетки в розово.

Културни методи

При отглеждане на бактерии се използват стационарният метод, методът на дълбоко култивиране с аерация и методът на течаща хранителна среда. В съответствие с методите на култивиране бактериалните култури се разделят на периодични (със стационарно и дълбоко култивиране) и непрекъснати (с поточно култивиране).

Стационарен методе най-често използваният в практиката. Съставът на медиите остава постоянен, с тях не се извършват допълнителни манипулации.

Метод на дълбока културасе използват при промишленото отглеждане на бактериална биомаса, за което се използват специални котли-реактори. Оборудвани са със системи за поддържане на температурата, подаване на различни хранителни вещества към бульона, смесване на биомасата и постоянно подаване на кислород. Създаването на аеробни условия по цялата дебелина на средата допринася за протичането на енергийните процеси по аеробния път, което допринася за максимално оползотворяване на енергийния потенциал на глюкозата и следователно за максимален добив на биомаса.

Метод на течаща среда(индустриален метод на култивиране) ви позволява постоянно да поддържате бактериална култура в експоненциална фаза на растеж, което се постига чрез постоянно добавяне на хранителни вещества и отстраняване определен бройбактериални клетки. Наличието на бактерии в етапа на експоненциален растеж осигурява максимален добив на различни биологично активни вещества (витамини, антибиотици и др.).

Първична идентификация на бактерии

В повечето случаи изследването на характеристиките на растежа за първична идентификация на патогени се извършва върху колонии, които са нараснали в рамките на 18-24 ч. Естеството на бактериалния растеж на различни среди може да предостави много полезна информация. На практика се използва сравнително малък набор от критерии. При течни среди обикновено се вземат предвид естеството на повърхностния (образуване на филм) или придънния растеж (вид утайка) и общата мътност на средата. Бактериите образуват колонии върху твърди среди, т.е. изолирани структури в резултат на растежа и натрупването на бактерии. Колониите възникват в резултат на растежа и възпроизвеждането на една или повече клетки. По този начин повторното засяване от колонията допълнително дава възможност да се работи с чиста култура на патогена. Растежът на бактерии върху плътни среди има по-характерни черти.

Някои бактерии отделят хемолизини- вещества, които разрушават червените кръвни клетки. На космическия кораб колониите им са заобиколени от прочистващи зони. Образуването на хемолизини (и съответно размерът на хемолизните зони) може да бъде променлив и за адекватно определяне на хемолитичната активност блюдата с култури трябва да се гледат срещу източник на светлина (фиг. 1-14). Активността на хемолизините може да се прояви в пълно или непълно унищожаване на червените кръвни клетки.

α-хемолиза.Разрушаването на еритроцитите може да бъде непълно, със запазване на клетъчната строма. Това явление се нарича α-хемолиза. Просветляването на средата около колониите обикновено е незначително, по-късно средата около колониите може да придобие зеленикав цвят.

В бактериологичната практика най-често се изследват захаролитични и протеолитични ензими.

Такъв растеж е характерен за пневмокока, както и за група т. нар. зелени стрептококи.

β-хемолиза.Много по-голяма група бактерии причиняват пълно унищожаване на червените кръвни клетки или β-хемолиза. Техните колонии са заобиколени от прозрачни зони с различни размери. Например, Streptococcus pyogenesи Стафилококус ауреусобразуват големи области на хемолиза, а Listeria monocytogenesили Streptococcus agalactiae- малки, дифузни зони. За определяне на хемолитичната активност не трябва да се използва шоколадов агар (SHA), тъй като получените зони на α- или β-хемолиза нямат характерни особености и причиняват същото позеленяване на средата.

Размерът и формата на колониите

Важни характеристики на колониите са техният размер и форма. Колониите могат да бъдат големи или малки. Размерът на колониите е характеристика, която прави възможно разграничаването на различни видове, родове и дори видове бактерии.

В повечето случаи грам-положителните бактериални колонии са по-малки от грам-отрицателните бактериални колонии. Колониите от бактерии могат да бъдат плоски, изпъкнали, изпъкнали, да имат депресиран или повдигнат център. Друга важна особеност е формата на ръбовете на колониите. При изследване на формата на колониите се взема предвид естеството на повърхността му: матова, лъскава, гладка или грапава. Краищата на колониите могат да бъдат гладки, вълнообразни, лобулирани (дълбоко вдлъбнати), назъбени, ерозирани, ресни и др. Размерът и формата на колониите често могат да се променят. Такива промени са известни като дисоциации. Най-често намират S - и R - дук асоциации. S-колониите са кръгли, гладки и изпъкнали, с гладки ръбове и лъскава повърхност. R-колонии - с неправилна форма, груби, с назъбени ръбове.

Цвят на колонията

Когато разглеждате културите, обърнете внимание и на цвета на колониите. По-често те са безцветни, бели, синкави, жълти или бежови; по-рядко - червено, лилаво, зелено или черно. Понякога колониите са преливащи, тоест блестят с всички цветове на дъгата. Оцветяването възниква в резултат на способността на бактериите да образуват пигмент. Върху специални диференциращи среди, съдържащи специални съставки или багрила, колониите могат да придобият различни цветове (черни, сини и др.) поради включването на багрила или тяхното възстановяване от безцветна форма. В този случай цветът им не е свързан с образуването на никакви пигменти.

Консистенция на колониите и особености на растеж върху средата

Полезна информация може да бъде дадена от консистенцията на колониите и характеристиките на растежа върху средата. Обикновено тази информация може да се получи чрез докосване на колониите с бримка. Колониите могат лесно да бъдат отстранени от средата, да враснат в нея или да причинят нейната корозия (образувайки пукнатини и неравности). Консистенцията на колониите може да бъде твърда или мека. меки колонии- мазна или кремообразна; може да бъде лигав (прилепва към примката) или ниски (разтягащ се зад примката).

твърди колонии- суха, восъчна, влакнеста или ронлива; може да бъде крехък и да се счупи при докосване от примката.

Миризмата е по-малко важен признак на колониите, тъй като асоциациите, които предизвиква, са субективни. По-специално, културите на Pseudomonas aeruginosa имат мирис на карамел, културите на Listeria - суроватка, Proteus - гнилостна миризма, Nocardia - прясно изкопана пръст.

Биохимични методи за идентифициране на бактерии

Има много методи, използвани за идентифициране на характеристиките на бактериалния метаболизъм, но на практика се използват малък брой от тях. Повечето от методите се основават на използването на диференциално диагностични среди, които включват различни показатели.

Способност за ферментация на въглехидрати

Способността за ферментация на въглехидрати се оценява чрез промяна на цвета на средата поради образуването на органични киселини (съответно има намаляване на pH), което води до промяна в цвета на индикатора.

"Пъстър" ред. Hiss среда се използва за определяне на захаролитичната активност; съдържат 1% пептонна вода (или MPB), индикатор Andrade и един от въглехидратите. Когато въглехидратът се разцепи, цветът на средата се променя от жълто до червено. Тъй като бактериите се отличават със способността си да ферментират определени въглехидрати, редовете епруветки придобиват пъстър вид. Следователно този набор от среди се нарича „пъстра“ (или цветна) серия.

Стъкло плува.За да се определи способността на микроорганизмите да ферментират въглехидратите с образуването на киселина и газ, стъклени поплавъци (къси тръбички, запечатани в единия край) се въвеждат в съдове със среда, които изплуват след напълването им с газ.

Разграждане на протеини

Някои бактерии проявяват протеолитична активност чрез секретиране на протеази, които катализират разграждането на протеините. Наличието на протеолитични ензими от групата на колагеназите се определя чрез инокулация с инжекция в NRM. При положителен резултат втечняването му се наблюдава под формата на фуния или на слоеве отгоре надолу. Способността за разцепване на протеини и аминокиселини може да се оцени и чрез промяна на цвета на средата, тъй като получените продукти - амоняк, индол и сероводород - изместват pH към алкалната страна, причинявайки промяна в цвета на индикатора.

образуване на амоняк.За да се определи способността за образуване на NH3, сеитбата се извършва в BCH и между нейната повърхност и тапата се фиксира лента от лакмусова хартия. Вположителен резултат прави хартията синя.

Образуване на индол и H2S.Обикновено, за да се определи способността за образуване на индол и сероводород, сеитбата се извършва и в BCH, хартиите се фиксират между повърхността му и тапата: в първия случай, импрегнирани с разтвор на оксалова киселина (когато се образува индол, хартията става червена), във втората - с разтвор на оловен ацетат (при образуване на H 2 S хартията почернява).Използват се и специални среди, съдържащи индикатори (например среда на Клиглер), или се добавят директно към средата след регистриране на видим бактериален растеж.

Тества за активност на нитрат редуктазата

Този тест се използва за идентифициране на отделни видове бактерии. Позволява ви да определите способността за възстановяване на нитратите до нитрити. Способността за редуциране на NO3 до NO2 се определя чрез култивиране в BCH, съдържащ 1% разтвор на KNO3. За определяне на нитритите към средата се добавят няколко капки реактив на Грийс. При положителен резултат се наблюдава появата на червен пръстен.

Хроматография

Хроматографските методи се използват за идентифициране на бактериите и установяване на тяхното систематично положение. Обекти за изследване - мастна киселинаклетъчна стена, уникални междинни продукти и крайни метаболити на жизнената активност на бактериите. Хроматографските системи обикновено са свързани с компютри, което значително опростява отчитането на резултатите. Най-честото идентифициране на късоверижни мастни киселини и тейхоева киселина е чрез газо-течна хроматография. течна хроматография под високо наляганеидентифицира миколовата киселина в клетъчните стени на микобактериите. Тънкослойна хроматография се използва за идентифициране на изопреноидни хинони на бактериалната клетъчна стена. При различните родове тяхното съдържание и набор са различни, но постоянни, което дава възможност да се установи системното положение на всеки конкретен вид.

индикаторни хартии

За изследване на биохимичната активност на бактериите широко се използват системи от индикаторни хартии или набори от мултимикротестове.

Система от индикаторни документи (SIB)- комплект дискове, импрегнирани с различни субстрати. Те могат да бъдат директно въведени в епруветки със суспензия от бактерии или предварително поставени в ямките на пластмасови плаки, където ще бъдат въведени изследваните бактерии. Така че на практика се използват комплекти Minitek Enterobacteriaceaeи Minitek Neisseriaза диференциална диагноза Enterobacteria (четиринадесет субстрата) и Neisseria (четири субстрата), което позволява да се получат резултати след 4 часа инкубация при 37 °C.

Multimicro тестови пакети- пластмасови плочи, в чиито ямки се поставят различни субстрати и индикатори. Към ямките се добавят различни разреждания на бактерии и се инкубират при 37°С. На практика тестовете RapID NH се използват за идентифициране на Neisseria и Haemophilus, RapID E за ентеробактерии и др., което ви позволява да получите резултати не по-късно от 4-8 часа.

Автоматични системи за идентификация на бактерии

Автоматичните системи за бактериална идентификация ви позволяват бързо (24-48 часа по-бързо от конвенционалните методи) да получите информация за вида на патогена и неговата чувствителност към антимикробни лекарства. В момента най-широко се използват системите тип Microscan и Vitek.

Микросканиращи системи.Използвайте турбидиметрични, колориметрични и флуоресцентни методи за идентифициране на бактерии. Системите се състоят от комплекти пластмасови плочи, съдържащи различни субстрати. Грам-положителните и грам-отрицателните бактерии се диференцират с помощта на флуоресцентни субстрати (време за анализ - 2 часа). За идентифициране на хемофили, анаероби и дрожди се използват хромогенни субстрати, които променят цвета си (времето за анализ е 4-6 часа). Минималните инхибиторни концентрации на различни антибиотици се определят от промяната в оптичната плътност. Системата е компютъризирана и автоматично извършва всички необходими изчисления.
Системи Vitek.Тази система използва един тип плочи с тридесет ямки. Към всяка ямка автоматично се добавя суспензия от бактерии с известна концентрация на микробни тела. Идентифицирането на микроорганизми (хемофили, нейсерии, дрожди и анаероби) се основава на турбидометрия на реакционната среда в ямката. В зависимост от свойствата на микроорганизма необходимото време за идентифицирането му варира от 4-8 до 18 ч. Системата е напълно компютъризирана и работи автоматично.

Методи за идентифициране на нуклеинови киселини

Методите за откриване на РНК и ДНК на патогени са намерили приложение главно в диагностиката на вирусни инфекции. Въпреки това са разработени тестови системи за идентифициране на някои придирчиви бактерии (например легионела, хламидия), както и за идентифициране на колонии. Neisseha gonorrhoeae, Haemophilus influenzaeтип b, стрептококи от група B, ентерококи и микобактерии.

Хибридизация на нуклеинови киселини

Най-често срещаните методи за хибридизация на нуклеинови киселини. Принципът на методите се дължи на способността на ДНК (и РНК) специфично да се комбинира (хибридизира) с комплементарни фрагменти от изкуствено създадени ДНК (и РНК) вериги, белязани с изотопи или ензими (пероксидаза или алкална фосфатаза). В бъдеще пробите се изследват по различни методи (например ELISA).

Метод на хибридизация на разтворадава най-бързи резултати. Проблемът с отстраняването на несвързани вериги от нуклеинови киселини възпрепятства широкото прилагане на метода.

Метод на хибридизация на твърда основаи неговата сандвич модификация е по-често срещана. Мембрани, изработени от нитроцелулоза или найлон, служат като твърда основа. Несвързаните реагенти се отстраняват чрез многократно промиване.

Биохимична идентификация на бактерии с помощта на тест системи

Други варианти на такива тестови системи осигуряват адсорбция на диференциращи субстрати върху хартиени или полимерни носители. Сред тях често се срещат системите Auxtab, Minitek, Morlok, MICRO-ID.

Такива системи са удобни за използване, те ви позволяват да изследвате едновременно широк обхватмикробни признаци, винаги готови за употреба във всякакви микробиологични лаборатории, те са прости и надеждни, изискват малки обеми инокулум, следователно спестяват лабораторни стъклени съдове, пипети. Компютърната обработка на получените резултати дава възможност за бързо определяне и оценка на вида на неизвестния патоген.

Производство на хранителни среди.Всички среди съдържат предимно естествени животни или билкови продуктии компоненти - месо, рибно брашно, яйца, мляко, кръв, екстракт от дрожди, картофи и други подобни. От тях се приготвят специални полуфабрикати под формата на екстракти, запарки, ензимни и киселинни хидролизати (месна вода, екстракт от дрожди, триптичен хидролизат на Хотингер, пептон и други), които са в основата на последващото проектиране на хранителни среди. Освен това към хранителните среди се добавят различни неорганични соли в зависимост от нуждите на микробната клетка. По правило концентрацията на натриев хлорид е 5,0 g / l, KH2PO4 - 0,2-0,5 g / l, MgSO4 7H2O, други соли се добавят със скорост 0,001 g / l. При необходими случаи към състава се добавят въглехидрати (захари, многовалентни алкохоли), аминокиселини в концентрация 0,5-1,0%, както и витамини (до 0,001 mg / ml).

За осигуряване на необходимата плътност на средата се използва агар-агар, който се получава от морски водорасли. Това е удобен и необходим компонент на средата, тъй като не се консумира от бактерии като субстрат за растеж. Образувайки гел във вода, той се топи при температура около 100 ° C и се сгъстява при 40 ° C. Източникът на желатин са богати на колаген субстрати. Сред тях са хрущяли, сухожилия, кости и други подобни. Гелът, който се получава в резултат на използването на желатин, се топи при температура около 32-34 ° C и се втвърдява при 28 ° C. Въпреки това, множество микроорганизми са способни да разграждат желатина, така че използването на последния като среден пълнител се счита за неподходящо. Най-често такива среди с желатин се използват за определяне на протеолитичните свойства на бактериите.

Производството на хранителни среди е сложен динамичен процес, който се нуждае от вниманието на бактериолог. Този процес се състои от няколко основни стъпки. Първо, необходимите сухи компоненти на средата се добавят към дестилирана вода съгласно предписанието, добре се разбъркват, разтварят се при нагряване. Не забравяйте да зададете pH на средата, което се определя с помощта на йонометър или индикаторни хартии. В този случай трябва да се отбележи, че след стерилизация реакцията на средата намалява с 0,2. Средата, съдържаща агар, се филтрира през филтър от памучна марля в горещо състояние, течната среда през хартиени филтри. При необходимост те се избистрят чрез утаяване или с помощта на яйчен белтък или суроватка. Средата се изсипва в специални матраци, колби, флакони и се затварят с памучно-марлеви запушалки с хартиени капачки. В зависимост от състава на средата се използват различни режими на стерилизация. Да, медиите, които съдържат въглехидрати, желатин се стерилизират в автоклав за 15 минути при температура 112 ° C или с течна пара при температура 100 ° C частично. Средата без въглехидрати може да се стерилизира в автоклав при 115-120°C за 20 минути. Ако съставът на средата включва компоненти, които са неустойчиви на температура, като естествен протеин, суроватка, урея, тогава те се стерилизират или чрез филтриране през бактериални филтри, или се добавят готови към стерилната среда. Стерилността на средата се контролира чрез витрифицирането им в термостат за няколко дни при температура 37 °C.

Даваме примери за производството на някои прости хранителни среди, които най-често се използват в микробиологичната практика и могат да бъдат основа за производството на по-сложни.

вода за месо. За производството му се използва прясно говеждо месо, което предварително се почиства от мазнини, фасции, сухожилия и други подобни, нарязва се на малки парченца и се прекарва през месомелачка. Получената кайма се залива с чешмяна вода в съотношение 1: 2, разбърква се и се оставя за един ден на хладно място. Получената инфузия се вари 30-60 минути, като периодично се отстранява котлен камък и след това се защитава. Течността се отделя от каймата, филтрира се през филтърна хартия или кърпа и се долива с чешмяна вода до първичния обем, след което се излива във флакони и се стерилизира при 1 атмосфера (температура 120 °C) за 30 минути. Стерилната месна вода е прозрачна, има жълтеникав цвят, а по стените на бутилката и на дъното има утайка от белтъчини, които са коагулирали. Следователно, при последващо използване на средата, тя се филтрира отново. Активната реакция на средата е 6.2.

Месо-пептонен бульон (MPB).За да се направи BCH, към месната вода се добавят 1% пептон и 0,5% натриев хлорид, необходимото рН се регулира с 20% разтвор на NAOH и се вари 30-40 минути при непрекъснато разбъркване. Бульонът се филтрира през хартиени или ленени филтри, налива се в бутилки, епруветки, проверява се активната реакция на средата и се стерилизира при 120 °C за 20 минути.

M'yaso-peptonniagar (MPA).Към месо-пептонния бульон се добавя ситно нарязан агар-агар (2-2,5%). Получената смес се вари до разтваряне на агар-агар, филтрира се, регулира се рН и се излива във флакони. Стерилизирането се извършва в продължение на 20 минути при температура 120 °C.

Среда с кръв, серум или асцитна течност.Тъй като тези носители не могат да се съхраняват дълго време, те се приготвят непосредствено преди употреба. За да направите това, стерилно добавете 5-10% прясна или дефибринирана кръв на овен, заек или друго животно към разтопената и охладена до 45-50 ° C MPA. Флаконите с агар се смесват старателно и се изсипват в петриевите чинийки, като се внимава да няма пяна.

Серум (5-10% серум) или асцитен агар (25% асцитна течност) се приготвя по същия начин.

Triptychniydig за Hottinger.Бульонът от него е по-икономичен от другите месо-пептонни среди, тъй като ви позволява да получите няколко пъти повече бульон от една порция месо. Тази среда съдържа голямо количество аминокиселини, следователно нейният буферен капацитет се увеличава и поради това стойността на активната реакция на средата е по-стабилна.

За да направите дайджест, вземете един килограм месо без сухожилия и мазнина, нарежете на малки парчета до 1-2 см., потопете в тенджера с двоен обем вода, която заври, и варете 15-20 минути, докато месото става сиво, което показва коагулация на протеина. Изважда се от течността и се прекарва през месомелачка. В течността, която остава, pH се настройва на 8,0, каймата се спуска там и се охлажда до 40 ° C. След това добавете 10% (към обема на течността) пресен панкреас, предварително почистен от съединителна тъкан, мазнини и прекаран през месомелачка два пъти. Вместо жлеза се използва сух препарат от панкреатин (0,5%). Получената смес се разклаща старателно и рН се регулира на 7,8-8,0. След 30 минути проверете pH. Ако активната реакция на средата не се промени към киселинната страна, това показва лошо качество на ензима. Когато рН на средата се стабилизира, сместа се излива в големи бутилки, като се пълнят на 1/3. Добавете до 3% хлороформ, затворете съдовете с гумени запушалки и разклатете енергично, за да се смесят течностите. Освобождават се излишни пари на хлороформ. След 1-2 години pH на средата отново се проверява, като се настройва на 7,4-7,6.

Добавете материал

Получената смес се оставя на стайна температура до 16 дни. През първите 3-4 дни рН на средата се проверява и регулира ежедневно, а флаконите се разклащат не по-малко от 3 пъти на ден. По-късно тази процедура може да бъде пропусната и средата не трябва да се разклаща толкова често. 1-2 дни преди края на цикъла на храносмилане разбъркването на средата се спира.

За завършеното висококачествено храносмилане свидетелстват избистрянето на течността, която придобива сламеножълт цвят, както и образуването на прашна утайка на дъното. Течността се филтрира лесно, проверява се за наличие на триптофан с помощта на проба с бромна вода (3-4 капки бромна вода се добавят към 3-4 ml от филтрата). При наличие на триптофан (до 2,0-3,0 g/l) цветът на средата се променя в розово-виолетов. Определя се общ азот, който нормално достига 11,0-12,0 g/l, и амин азот (до 7,0-9,0 g/l).

Хидролизатът се филтрира през хартиен или ленен филтър, бутилира се и се автоклавира при 120°С за 30 минути. В тази форма може да се съхранява дълго време.

Използва се за приготвяне на бульон Хотингер. За целта се добавят до 100-200 ml от хидролизата, 800-900 ml дестилирана вода, 0,5% натриев хлорид и 0,2% монозаместен натриев фосфат. pH се регулира до 7,4-7,6, излива се във флакони и се стерилизира за 20 минути при 120 °C.

Месо-пептонов агар на базата на хидролизата на Hottinger се приготвя по рецептата на обичайния MPA.

Днес, като правило, бактериолозите се опитват да използват стандартни сухи култури, които се произвеждат от бактериологичната индустрия. Такива среди могат значително да подобрят резултатите от микробиологичните изследвания и да ги стандартизират.

За култивиране на бактерии широко се използват среди без протеини, в които много органотрофни, включително патогенни, бактериални видове растат добре. Тези среди включват много компоненти.

Култивирането в синтетични среди по метода на белязаните атоми дава възможност да се диференцират бактериите по-подробно според естеството на тяхната биосинтеза.

За диференциацията на прототрофни и ауксотрофни бактерии се използват широко селективни медии.

Прототрофите растат в минимална среда, която съдържа само соли и въглехидрати, тъй като те сами могат да синтезират нужните им за развитие метаболити, докато ауксотрофите се нуждаят от среда, която съдържа определени аминокиселини, витамини и други вещества.

На плътни хранителни среди бактериите се образуват с различна форма и размер колонии- видими натрупвания на микроорганизми от същия вид, които се образуват в резултат на размножаване от една или повече клетки. Колониите са плоски, изпъкнали, куполовидни, вдлъбнати, повърхността им е гладка (S-образна), грапава (R-образна), набраздена, туберкулозна, ръбовете са равни, назъбени, влакнести, с ресни. Формата на колониите също е разнообразна: кръгла, с форма на розетка, звездовидна, дървовидна. По размер (диаметър) колониите са разделени на големи (4-5 mm), средни (2-4 mm), малки (1-2 mm) и джуджета (по-малко от 1 mm).

Под общото име "салмонелоза" се комбинират заболявания, които се причиняват предимно от бактерии от рода салмонелаи обикновено протичат със симптоми на септицемия или с подостър, понякога хроничен ход и възпаление стомашно-чревния тракт, увреждане на черния дроб, дихателните органи, ставите или аборти при жени.

Салмонелозата е заболяване на селскостопански животни от всякакъв вид, птици, козина и дива фауна. При млади животни на възраст от 10 дни до 4 месеца заболяването протича остро, в септична форма, придружено от повишаване на телесната температура, ентерит, бронхопневмония, артрит и парализа. При възрастни животни се отбелязват бактерионосимост, аборт, периоди на обостряне.

При хората токсичните инфекции се причиняват от салмонела, адаптирана към тялото на животни и птици.

От 1980 г различни болести по животните, свързани със салмонелоза, са описани под различни имена. През 1885 г. Сьомга изолира първия причинител на салмонелоза в чиста култура. S. cho-erae(предишно име S. suipestifer),който отдавна се смята за причинител на чума по свинете. Шотмюлер през 1890 г. нарече паратифа заболяване на хората, причинителите на което са S. паратифия A и B, тъй като симптомите на заболяването са подобни на коремен тиф. Впоследствие масови заболявания по животните, причинени от подобни S. паратифиябактерии, наричани още паратиф. Това име обаче е остаряло и е заменено. Пфайфер, Мюлер и Битер откриха това S. паратифия A и B са патогенни само за хората, докато видовете и сортовете, изолирани от животни и птици, причиняват токсични инфекции при хората.

Салмонелите в последното издание на Краткия ключ към бактериите на Bergi са причислени към семейството enterobacteriaceae,племе Escherichiaee, род Salmonella,семейство Enterobacteriaceaeи включва 12 рода: Escherichia, Edwardsiella, Citrobarter, Salmonella, Shigella, Klebsiella, Enterobacter, Hafnia, Serratia, Proteus, Erwinia, Jersinia.Родът Salmonella включва 65 групи (повече от 2000 серовара). Международният комитет по номенклатурата разделя рода Salmonella на четири подрода (Таблица 15.1):

1. S. kauffmanni.Той включва повечето от патогенните за хората Salmonella, серологични групи A, B, C, D, E.

Таблица 15.1

Биохимична диференциация на салмонелоза

Конвенции: n--положителен;--отрицателен; P - различен;

  • (+) - късно, но винаги положително; x - късно, но не винаги положително
  • 2. S. salamae.Различава се от първия подрод по способността да втечнява желатина и да ферментира натриев малонит.
  • 3. S. Arizonae.Ферментира лактозата, намираща се в птици, влечуги, бозайници; в последните годиниоткрити при хора при фебрилни състояния със симптоми на диария и гастроентерит.
  • 4. S. houtenau.Предписани са биохимични атипични салмонели.

Общи културни и биохимични характеристики на представителите на рода Salmonella (с малки изключения) позволяват да се разграничат от други групи от семейство Enterobacteriaceae и подобни групи (Едуардсиелаи Citrobacter).

За биохимична идентификация Citrobacter иот четири подрода на Salmonella, на практика се използват пет теста: наличие на желатиназа, използване на лизиат, лактоза, глицерол и декарбоксилиране на лизин.

Kaufman разделя рода Salmonella на четири подрода според тяхната антигенна структура (Таблица 15.2).

Антигенна структура на салмонела

Група и видове (серовар)

Антигенна структура

Соматичен антиген

Антиген на флагела

специфична фаза

Неспецифична фаза

S. paratyphi A

S. typhimurium

S. abortus-equi

S. abortus-ovis

S.paratyphi B

S. abortus bovis

S. cholerae-suis

S. typhi-suis

S. enteritidis

С. Дъблин

S. rastoc

S. gallinarum

S. pullorum

биологични свойства.Бактериите от семейство Salmonella имат следните общи свойства: те са грам-отрицателни, не образуват спори, нямат оксидаза, редуцират нитратите до нитрити, ферментират глюкозата, растат добре на обикновена среда, факултативни анаероби.

Морфология. Това са малки пръчки с усукани краища, дълги I-3 и диаметър 0,5-0,8 микрона, като правило, мобилни, освен S. gallinarumи S. rillorum.Сред другите видове се срещат неподвижни мутанти. Те не образуват капсули. Техните колонии са с диаметър 2-4 мм. На МРА - прозрачен, нежен, синкав; на средата на Ендо - розов, прозрачен; на средата на Плоскирев - безцветен; на средата на Левин - прозрачен с виолетов оттенък;

Ензимни свойстваса разнообразни не само в един подрод, те могат да варират в рамките на един и същ серовар. Салмонелите образуват сероводород и не образуват индол, не ферментират лактоза и салицин, използват цитрат, ферментират глюкоза и маниит. В най-новите научни изследвания Salmonella се диференцира чрез 26 биохимични теста.

Устойчивост.Ендотоксините на салмонела са дълготрайни и силно устойчиви. Токсичното им действие не отслабва в дебелината на месото при готвене на големи парчета. При температура 65-70°C салмонелите оцеляват дълго време, не умират в 8-10% разтвор на оцетна киселина в продължение на 18 ч. В почвата, оборския тор, постелята салмонелите се задържат няколко години и могат да се размножават във фекални отлагания в щандове за свине, в течни фуражи, вода, почви, наторени с оборски тор. Размножават се във всички хранителни продукти с достатъчна влажност и температура (7-45°C), pH от 4,1 до 9,0. Използва се за дезинфекция, 3% разтвор на натриев хидроксид, белина, съдържаща 2% активен хлор, 20% суспензия на прясно гасена вар, 2% разтвор на формалдехид надеждно дезинфекцира помещенията с експозиция от 1-1,5 часа. Провеждат се салмонелни почви от падоки и пасища по метода, разработен от С.М. Губкин (1953).

Токсигенност.Салмонела притежава ендо- и екзотоксини. Ендотоксините причиняват хеморагично възпаление на червата и причиняват диария и други признаци на заболяване. Екзотоксините принадлежат към групата на невротоксините. Действието на токсините е придружено от диспепсия, ентероколит, увреждане на централната нервна система, докато телесната температура се повишава, появява се задух, координацията на движенията се нарушава, рефлексите отслабват. При нарастваща интоксикация се появяват конвулсии при животните.

Антигенна структурасалмонела е комплексна. Те имат няколко антигена: O, H, VI, M и K. O-антигенът е термостабилен (издържа на кипене в продължение на 2,5 часа), инхибира се от формалин, намира се на клетъчната повърхност и се състои от фосфолипидни полизахаридни комплекси. Специфичността на О-антигена в серологичните реакции се дължи на наличието на определени полиозиди в него, т.е. дидеоксихексозни захари, разположени в краищата на полизахаридните вериги. Серологичните варианти на Salmonella за O-антиген са обозначени с арабски цифри.

Един от компонентите на соматичния антиген е Yi антигенът, който принадлежи към К-антигените. След откриването на Uantigen (Felix and Ritt, 1934), той е наречен антиген на вирулентност. Но той не служи, както вече е доказано, като пряк носител на вирулентност. Неговото присъствие на повърхността на микробна клетка предотвратява аглутинацията на бактериите в O-серума, което затруднява диференцирането на Salmonella. Uantigen е полимер, той е термолабилен.

Уантигенът е лабилно вещество; изчезва при отглеждане на микроби в хранителни среди при добавяне на фенол към тях, както и при ниски (20 °C) или високи (40 °C) температури, напълно се унищожава при кипене и под действие на фенол, частично се променя при излагане на формалин и температура от 60 °C за 30 минути.

H-антигенът на Flagella е хетерогенен; Състои се от две фази: първата или специфична фаза, която се аглутинира от специфичен видов серум, и втората, или неспецифична фаза, която се аглутинира не само от видове, но и от групов серум. Салмонелозата, която има две фази на Н-антигена, се нарича двуфазна, за разлика от монофазната, имаща само специфичен Н-антиген. Н-антигенът е термолабилен, устойчив на формалин, чувствителен към киселини и алкохол и по природа е протеин.

Антигенната структура на Salmonella подлежи на променливост. Техните антигенни комплекси са обект на внезапни вариации по време на прехода от S- към R-форма, както и в резултат на трансдукция, лизогенно превръщане и конюгиране.

Има няколко вида дисоциация на салмонела:

  • 1) H-O-вариации, т.е. преход от бичукова към небичукова форма;
  • 2) I.-, 8-вариации, т.е. преход от гладък към грапав. В изотоничен разтвор на натриев хлорид 11-формите дават нестабилен аглутинат, докато В-формите остават в суспензия.
  • 3) U-U-вариациите се отнасят само за Uantigen. Y-формата съдържа Uantigen и е O-не-аглутинирана. Y-формата не съдържа Uantigen и се счита за O-аглутинираща. Има междинни форми.

В практиката на серологична диференциация на Salmonella, въпреки променливостта на тяхната антигенна структура, се вземат предвид само три основни антигена (O, H, VI).

Когато се характеризират свойствата на Salmonella, не може да не се спре на тяхната така наречена генетична пластичност, на връзката на последните в тези микроорганизми с множеството на техните серовари и на въпроса до каква степен тази генетична пластичност може да повлияе възможността за тяхното точно идентифициране.

Салмонела често се избира като модел за генетични изследвания през последните години. Вече споменахме естествените вариации в антигенните структури на бактериите. Известни са и вариации, възникнали под влиянието на бактериофаги и други фактори. Три механизма на генетична рекомбинация, открити в Salmonella, са посочени по-горе. Феноменът на трансдукция при салмонела е описан през 1952 г. от Зиндер и Леденберг. В същото време умереният бактериофаг PT22, действащ върху различни серовари, може да трансдуцира Н-антигена и другите му свойства. Въз основа на това авторите не изключват възможността за подобни промени в микроорганизма в естествени условия.

По време на лизогенна конверсия, гените на бактериофаги пренасят функцията като част от бактериалната клетка. Лизогенното състояние, причинено от конвертиращия фаг, води до промяна в О антигените. В този случай новопридобитият О-антиген се запазва, докато микробът остава лизогенен.

Конюгирането води до хибриди с нови антигенни свойства. Конюгирането може да доведе до трансфер на плазмиди и появата на резистентен фактор (R фактор) или ново свойство. Проблемът на съвременността е широкото разпространение на формите на салмонела, които са полирезистентни към лекарствени вещества.

От гореизложеното са ясни проблемите и трудностите при идентифицирането на Salmonella, необходимостта от систематично определяне на серовари на изолирани култури, изследването на тяхната антибиотична резистентност и нейното преодоляване.

За серологично типизиране на изолирани щамове на Salmonella се използва рецепторен анализ, използвайки специфични аглутиниращи серуми на Salmonella, както група, така и вид.

ИмунитетТой е антиинфекциозен и антитоксичен по природа. По правило първо възниква нестерилен имунитет, който по-късно може да стане стерилен. Имунитетът често възниква в резултат на латентна инфекция. Такъв имунитет се нарича депресия.

Първата доза антиген е от съществено значение за създаването на имунитет. Прекомерната доза води до потискане на имунните сили на организма, особено при млади животни. Малките дози обикновено се неутрализират от тялото и следователно не предизвикват имунитет. Някои автори смятат 2 ml микробни тела за оптимална имунизираща доза.

За формирането на стабилен имунитет е необходима определена степен и продължителност на антигенното действие (персистиране на живи бактерии в тъканите). В тази връзка ваксинациите в ранния постнатален период не дават желания ефект, както и комбинацията от имунизация с използването на антибиотична терапия. О-антигенът се счита за водещ антиген в имуногенезата. При първите етапи на формиране на имунитета се образуват 1 2 М и 1 2 0. Под въздействието на живи ваксини, започвайки от 2-та седмица, се образуват антитела и се засилва фагоцитната реакция, които достигат своя максимум към 5-6-та. седмица.

Патогенеза.Продължителността на инкубационния период зависи от начина на заразяване, дозата и вирулентността на патогена и имунното състояние на организма. При естествени условия продължителността на инкубационния период при млади животни от различни животински видове варира от 2-5 до 10-25 дни. С хранителния път на инфекция патогенът бързо прониква в лимфния апарат на чревната стена, а оттам в лимфната и кръвообращението. Пейеровите петна и единичните фоликули се увеличават, ясно стърчат под лигавицата, образувайки възвишения.

Учебникът се състои от седем части. Част първа - "Обща микробиология" - съдържа информация за морфологията и физиологията на бактериите. Втора част е посветена на генетиката на бактериите. Третата част – „Микрофлора на биосферата“ – разглежда микрофлората на околната среда, нейната роля в кръговрата на веществата в природата, както и човешката микрофлора и нейното значение. Четвърта част - "Учението за инфекцията" - е посветена на патогенните свойства на микроорганизмите, тяхната роля в инфекциозния процес, а също така съдържа информация за антибиотиците и механизмите им на действие. Пета част – „Доктрината за имунитета” – съдържа съвременни идеи за имунитета. Шестата част – „Вирусите и болестите, които причиняват“ – предоставя информация за основните биологични свойства на вирусите и болестите, които те причиняват. Част седма - "Частна медицинска микробиология" - съдържа информация за морфологията, физиологията, патогенните свойства на патогените на много инфекциозни заболявания, както и съвременните методи за тяхната диагностика, специфична профилактика и терапия.

Учебникът е предназначен за студенти, специализанти и преподаватели от висшите медицински образователни институции, университети, микробиолози от всички специалности и практици.

5-то издание, преработено и разширено

Специфична профилактика не се използва, въпреки че са предложени различни ваксини от убити и живи (мутантни) щамове S. typhimurium.